G蛋白偶联受体（GPCR）蛋白提取和稳定试剂盒-100T

【保存条件】

GPCR蛋白提取及稳定剂保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存一年

【产品概述】

提取后稳定受体的天然和功能形式面临诸多挑战，这使得细胞膜外研究极其困难。本提取试剂可在 1-2 小时内高效地从哺乳动物细胞或组织中提取功能性受体。大多数功能性 GPCR 检测必须在受体提取后立即进行，因为受体活性会随着时间的推移迅速下降。

本品主要用于从培养的哺乳动物细胞或组织中提取和稳定G偶联蛋白受体 (GPCR) 及其他膜相关蛋白。该提取试剂将受体封装在经过专门优化的去垢剂胶束中，以确保提取后受体在 4°C 下储存时可保持长达1周的功能，在 -20°C下储存时可保持长达1个月的功能。

本品每1ml可用于1×10⁶个细胞或50-100 mg组织的GPCR及各类膜蛋白的提取。

【操作方法】

使用前：GPCR提取及稳定剂根据用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，每1ml GPCR蛋白提取及稳定试剂中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，现配现用。

A: 对于贴壁细胞：

1. 在培养板上用10-15 mL预冷PBS清洗细胞两次。

2. 加入1 mL预冷PBS，用细胞刮刀将细胞从板表面刮掉（或胰酶消化收集细胞，消化后记得及时终止消化）。

3. 将 1×10⁶个细胞重悬于1 mL预冷的PBS中。收集细胞悬液，4°C，500 × g 离心5分钟。

4. 小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C 下500 × g离心5分钟，弃去上清液。

5. 将1 mL预冷的GPCR提取及稳定剂（含抑制剂）加入细胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混匀，然后短暂涡旋以获得均匀的细胞悬液。在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。

注意：对于过度表达系统，在此步骤需要进行轻度机械破坏以获得最佳效果（如对于 Expi293 系统，使用 Dounce 均质机或手持式组织研磨机进行均质化可增加活性受体的产量）。

6. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。

7. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在4°C下保存长达1周或在-20°C下保存长达 1个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。

注意：对于悬浮细胞GPCR提取，以 500×g离心5分钟收获1×10⁶个细胞。用10-15 mL冷PBS清洗收获的细胞沉淀物两次，并在 4°C下以500×g离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C，500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。后进行步骤5及后续步骤。

B: 对于组织样本：

1. 将50-100 mg 组织置于5 mL离心管中。加入4 mL预冷PBS，短暂涡旋，弃去洗液。

2. 转移至 2 mL Dounce匀浆器中，用剪刀将组织剪成小块。加入1 mL预冷GPCR 提取和稳定剂（含抑制剂），匀浆至均匀悬浮（10-15 次）。

注意：使用手动组织研磨机进行均质化是可以的，但留意可能会导致起泡，勿使用超声破碎。

3. 将匀浆转移到新管中，在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。

4. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。

5. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在 4°C 下保存长达 1 周或在 -20°C 下保存长达 1 个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。

【注意事项】

1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。

2. 多数膜蛋白试剂不能很好用于GPCR的提取，本产品可同时用于GPCR和各类膜蛋白的提取。如加上样缓冲液膜蛋白无法溶解后出现沉淀，可适当超声再加样（若无则不需要）。

3. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。