产品描述
【保存条件】
-20℃保存，有效期12个月
【概述】
本试剂盒利用分步裂解法，通过优化不同缓冲液的离子强度和去污剂浓度，先破坏细胞质膜释放胞浆蛋白，再通过离心收集完整的细胞核，最后裂解细胞核释放核蛋白。提取的蛋白保持天然活性，可用于 Western Blot、EMSA、转录因子活性分析等下游实验。
【实验准备】
1. 试剂准备：将CE I、CE II和NE溶液置于冰上融解，使用前混匀。
2. 抑制剂添加：使用前数分钟内，向所需体积的抽提液中加入蛋白酶抑制剂。
按推荐比例加入相应的蛋白酶或蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（如ES-8315蛋白酶抑制剂混合物Cocktail(通用型, 100×)或ES-8317 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(All-in-one,50×)，现配现用）。
3. 样本起始量及预处理：
贴壁细胞：2×106细胞（约20 µL细胞沉淀体积）。用预冷PBS洗一遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。500×g离心5分钟收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
悬浮细胞：2×106细胞（约20 µL细胞沉淀体积）。4℃条件下以500×g离心5分钟收集细胞，期间使用预冷PBS洗涤一次。
组织：约30-60mg组织。首选新鲜采集的组织；如果是冻存组织，必须从-80℃直接取出后迅速切碎，严禁室温自然解冻（解冻过程中产生的冰晶会刺破溶酶体造成蛋白降解）。
【操作步骤】
第一阶段：样本前处理
A. 培养细胞（贴壁/悬浮） | B.组织样本 |
(1) 收集：离心收集细胞（约2×106细胞），用预冷PBS洗涤1次。 (2) 除液：彻底吸干上清，留下细胞沉淀备用。 (3) 下接：直接进入第二阶段步骤2。 | (1) 剪碎：将组织尽可能剪碎成微小碎片。 (2) 配液：按20:1比例预混CE I与CE II，配制成“组织匀浆液”。 (3) 匀浆：按每60 mg组织加入200 µL组织匀浆液的比例，使用玻璃匀浆器在冰上充分匀浆（选择机械匀浆仪更优。若使用组织30mg则使用量减半，下述实验步骤亦减半试剂用量）。 (4) 粗提：将匀浆液转至离心管，冰浴15分钟。随后4℃, 1,500×g离心5分钟。 (5) 下接：吸取上清（含部分胞浆蛋白）暂存；将沉淀接第二阶段步骤2操作。 |
第二阶段：胞浆蛋白提取
2. 重悬：向上一步骤细胞沉淀中加入200µL CE I（含抑制剂）。
3. 分散：最高速剧烈涡旋5-10秒，使细胞完全悬浮分散。
4. 冰浴孵育：置于冰上孵育10-15分钟，期间可涡旋2-3次。
5. 胞浆促裂：加入10µL CE II，最高速剧烈涡旋5-10秒。若沉淀未完全分散，可适当延长涡旋时间。
6. 冰浴平衡：冰浴1分钟。
7. 离心：4℃下，12,000 ×g离心5分钟。
8. 收集胞浆蛋白：立即吸取上清至预冷管中，即为细胞浆蛋白。
第三阶段：核蛋白提取
9. 沉淀洗涤（可选）：为防止胞浆蛋白污染，请彻底吸干余液。若沉淀较粘稠或对纯度要求极高，可用200µL PBS重悬后再次离心弃上清。
10. 核裂解：向沉淀中加入50µL NE（含抑制剂）。
11. 释放：剧烈涡旋重悬沉淀，冰上孵育10分钟。注意：期间每隔2分钟需剧烈涡旋5秒，以助核蛋白充分释放。
12. 收集核蛋白：4℃下，12,000-16,000 ×g离心10分钟。收集上清即为细胞核蛋白。
【注意事项】
1. 全程低温：全过程（包括离心、匀浆、涡旋间隙）必须在4°C或冰上进行，预冷离心管和离心机是实验成功的保障。
2. 交叉污染防控：吸取胞浆蛋白时切勿触及核沉淀；提取核蛋白前务必吸净残余胞浆液。
3. 配制建议：抑制剂添加后的CE I和NE必须现配现用。严禁将添加了抑制剂的提取液长期储存，以免抑制剂失效影响实验结果。
4. 得率参考：每2×106细胞约得胞浆蛋白2-5mg/mL，核蛋白1.2-3.0mg/mL。新鲜肝脏组织约得细胞浆蛋白3-10mg/mL，核蛋白3-10mg/mL，结果随样本种类和状态有所波动。
5. DNA拖尾处理：若核蛋白电泳拖尾，说明DNA含量过高。可在步骤11结束后进行短时间超声处理（如30W, 3s）以剪切DNA。
6. 匀浆标准化：坚韧组织若匀浆不彻底，细胞核会包裹在组织碎屑中导致得率下降。建议使用机械匀浆。
产品规格
- 货期
- 现货
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-6100、蛋白提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
-20℃保存
常见问题 (FAQ)
提取的蛋白如何保存？
提取后蛋白：全程冰上 → 提取后立即分装 -80℃，避免反复冻融。
可用于哪些下游应用？
Western Blot、EMSA、转录因子活性分析。扩展：① NF-κB / p53 等转录因子核-质转运研究；② 染色质相关蛋白分析（结合超声处理）；③ 信号通路核内表达研究；④ 报告基因辅助分析。
核蛋白电泳拖尾如何处理？
DNA 拖尾处理：若核蛋白电泳拖尾，说明 DNA 含量过高。可在核蛋白释放步骤结束后进行短时间超声处理（如 30W, 3s）以剪切 DNA。
交叉污染如何控制？
交叉污染防控：吸取胞浆蛋白时切勿触及核沉淀；提取核蛋白前务必吸净残余胞浆液。额外推荐：① 可选洗涤步骤——提取核蛋白前可用 200 µL PBS 重悬沉淀后再次离心弃上清，对纯度要求极高时执行；② 用内参 WB 验证：胞浆 GAPDH/Tubulin、核 Lamin B/Histone H3。
抑制剂配置要点？
抑制剂添加：使用前数分钟内，向所需体积的抽提液中加入蛋白酶抑制剂。按推荐比例加入相应的蛋白酶或蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（如 ES-8135 蛋白酶抑制剂混合物（通用型，100×）或 ES-8137 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（All-in-one, 50×）），现配现用。抑制剂添加后的 CE I 和 NE 必须现配现用。严禁将添加了抑制剂的提取液长期储存，以免抑制剂失效影响实验结果。
组织取材有什么特殊提示？
首选新鲜采集的组织；如果是冻存组织，必须从 -80℃ 直接取出后迅速切碎，严禁室温自然解冻（解冻过程中产生的冰晶会刺破溶酶体造成蛋白降解）。对于坚韧组织（如心、肌肉）若匀浆不彻底，细胞核会包裹在组织碎屑中导致得率下降，建议使用机械匀浆。
组织流程的关键？
① 剪碎组织至微小碎片；② 配液：按 20:1 比例预混 CE I 与 CE II，配制成组织匀浆液；③ 匀浆：每 60 mg 组织加入 200 µL 组织匀浆液，冰上玻璃匀浆器充分匀浆（机械匀浆仪更优；30 mg 组织则减半试剂用量）；④ 粗提：匀浆液转离心管，冰浴 15 min，4℃ 1,500×g 离心 5 min；⑤ 下接：吸取上清（含部分胞浆蛋白）暂存；将沉淀进入第二阶段。
细胞流程参数？
① 收集：离心收集细胞（约 2×10⁶），预冷 PBS 洗涤 1 次，彻底吸干上清；② 重悬：加 200 µL CE I（含抑制剂），最高速剧烈涡旋 5–10 s 完全悬浮；③ 冰浴孵育 10–15 min，期间可涡旋 2–3 次；④ 胞浆促裂：加 10 µL CE II，最高速剧烈涡旋 5–10 s（沉淀未完全分散可适当延长）；⑤ 冰浴 1 min；⑥ 4℃ 12,000×g 离心 5 min；⑦ 立即吸取上清=细胞浆蛋白；⑧ 核蛋白提取：沉淀加 50 µL NE（含抑制剂），剧烈涡旋后冰上孵育 10 min（每隔 2 min 剧烈涡旋 5 s 助核蛋白释放）；⑨ 4℃ 12,000–16,000×g 离心 10 min，上清=细胞核蛋白。
起始量与典型得率？
说明书规范：① 贴壁细胞 / 悬浮细胞：约 2×10⁶ 细胞（约 20 µL 细胞沉淀体积）；② 组织：30–60 mg（按 60 mg 组织 + 200 µL 组织匀浆液配置）。得率参考（说明书原文）：每 2×10⁶ 细胞约得胞浆蛋白 2–5 mg/mL，核蛋白 1.2–3.0 mg/mL。新鲜肝脏组织约得细胞浆蛋白 3–10 mg/mL，核蛋白 3–10 mg/mL，结果随样本种类和状态有所波动。
本试剂盒的核心原理？
本试剂盒利用分步裂解法，通过优化不同缓冲液的离子强度和去污剂浓度，先破坏细胞质膜释放胞浆蛋白，再通过离心收集完整的细胞核，最后裂解细胞核释放核蛋白。提取的蛋白保持天然活性，可用于 Western Blot、EMSA、转录因子活性分析等下游实验。包装含 CE I（胞质提取 I）、CE II（胞质提取 II）、NE（核蛋白提取）三种缓冲液。
