EK-6100 细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒

【保存条件】

-20℃保存，有效期12个月

【概述】

本试剂盒利用分步裂解法，通过优化不同缓冲液的离子强度和去污剂浓度，先破坏细胞质膜释放胞浆蛋白，再通过离心收集完整的细胞核，最后裂解细胞核释放核蛋白。提取的蛋白保持天然活性，可用于 Western Blot、EMSA、转录因子活性分析等下游实验。

【实验准备】

1. 试剂准备：将CE I、CE II和NE溶液置于冰上融解，使用前混匀。

2. 抑制剂添加：使用前数分钟内，向所需体积的抽提液中加入蛋白酶抑制剂。

按推荐比例加入相应的蛋白酶或蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（如ES-8315蛋白酶抑制剂混合物Cocktail(通用型, 100×)或ES-8317 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(All-in-one,50×)，现配现用）。

3. 样本起始量及预处理：

贴壁细胞：2×10⁶细胞（约20 µL细胞沉淀体积）。用预冷PBS洗一遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。500×g离心5分钟收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

悬浮细胞：2×10⁶细胞（约20 µL细胞沉淀体积）。4℃条件下以500×g离心5分钟收集细胞，期间使用预冷PBS洗涤一次。

组织：约30-60mg组织。首选新鲜采集的组织；如果是冻存组织，必须从-80℃直接取出后迅速切碎，严禁室温自然解冻（解冻过程中产生的冰晶会刺破溶酶体造成蛋白降解）。

【操作步骤】

第一阶段：样本前处理

第二阶段：胞浆蛋白提取

2. 重悬：向上一步骤细胞沉淀中加入200µL CE I（含抑制剂）。

3. 分散：最高速剧烈涡旋5-10秒，使细胞完全悬浮分散。

4. 冰浴孵育：置于冰上孵育10-15分钟，期间可涡旋2-3次。

5. 胞浆促裂：加入10µL CE II，最高速剧烈涡旋5-10秒。若沉淀未完全分散，可适当延长涡旋时间。

6. 冰浴平衡：冰浴1分钟。

7. 离心：4℃下，12,000 ×g离心5分钟。

8. 收集胞浆蛋白：立即吸取上清至预冷管中，即为细胞浆蛋白。

第三阶段：核蛋白提取

9. 沉淀洗涤（可选）：为防止胞浆蛋白污染，请彻底吸干余液。若沉淀较粘稠或对纯度要求极高，可用200µL PBS重悬后再次离心弃上清。

10. 核裂解：向沉淀中加入50µL NE（含抑制剂）。

11. 释放：剧烈涡旋重悬沉淀，冰上孵育10分钟。注意：期间每隔2分钟需剧烈涡旋5秒，以助核蛋白充分释放。

12. 收集核蛋白：4℃下，12,000-16,000 ×g离心10分钟。收集上清即为细胞核蛋白。

【注意事项】

1. 全程低温：全过程（包括离心、匀浆、涡旋间隙）必须在4°C或冰上进行，预冷离心管和离心机是实验成功的保障。

2. 交叉污染防控：吸取胞浆蛋白时切勿触及核沉淀；提取核蛋白前务必吸净残余胞浆液。

3. 配制建议：抑制剂添加后的CE I和NE必须现配现用。严禁将添加了抑制剂的提取液长期储存，以免抑制剂失效影响实验结果。

4. 得率参考：每2×10⁶细胞约得胞浆蛋白2-5mg/mL，核蛋白1.2-3.0mg/mL。新鲜肝脏组织约得细胞浆蛋白3-10mg/mL，核蛋白3-10mg/mL，结果随样本种类和状态有所波动。

5. DNA拖尾处理：若核蛋白电泳拖尾，说明DNA含量过高。可在步骤11结束后进行短时间超声处理（如30W, 3s）以剪切DNA。

6. 匀浆标准化：坚韧组织若匀浆不彻底，细胞核会包裹在组织碎屑中导致得率下降。建议使用机械匀浆。