产品描述
【保存条件】
4℃保存3个月，-20℃保存一年
【实验前准备】
1. 1×裂解缓冲液LBH稀释：取1mL的10×裂解缓冲液LBH加入9mL去离子水，混匀。
2. 抑制剂添加（关键）：临用前，向所需体积的1× LBH和EXB中加入蛋白酶抑制剂（如ES-8315蛋白酶抑制剂混合物Cocktail(通用型, 100×)或ES-8317 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(All-in-one,50×)，现配现用）。
3. 设备预冷：提前开启冷冻离心机至4℃。
【操作步骤】
A.培养细胞核蛋白提取：
1. 细胞收集（起始量：约106–107个细胞）：
贴壁细胞：用预冷PBS洗一遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。500×g离心5分钟收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
悬浮细胞：4℃条件下以500×g离心5分钟收集细胞，期间使用预冷PBS洗涤一次。
2. 细胞溶胀（去胞浆）：将收集的细胞中加入500μL 1×裂解缓冲液LBH（含抑制剂）并在冰上孵育15分钟，让细胞膨胀破裂。
3. 促裂：加入30μL裂解缓冲液CA ，立即剧烈涡旋10秒，使细胞膜彻底破碎释放胞浆。
4. 沉降细胞核：在4℃下以10,000–12,000×g立即离心1分钟。
5. 核洗涤（可选，提高纯度）： 向核沉淀中加入500 μL冰冷PBS，轻轻颠倒混匀，4℃下 10,000–12,000×g离心1分钟，弃上清。
注：此步骤能显著减少核蛋白中的胞浆残留（如GAPDH污染）。
6. 核蛋白抽提：向核沉淀中加入50 μL提取液缓冲液EXB（含抑制剂）。冰上孵育30分钟。期间每隔10分钟剧烈涡旋10秒，辅助核蛋白从染色质上脱落。
7. 收集：在4℃下以14000×g离心30分钟，收集上清即为细胞核蛋白。
B. 组织中提取核蛋白（起始量：约100mg）：
1. 切碎洗涤：取100mg组织，PBS洗涤2次除去血污，剪成碎糜状。
2. 匀浆裂解：加入1,000 μL 1×LBH（含抑制剂），置于预冷的匀浆器中冰浴匀浆。低温匀浆组织直到>90%的细胞破碎，可取一部分于显微镜下观察判断。
3. 沉降细胞核：4℃下，12,000×g离心20分钟。
4. 弃胞浆：丢弃上清液。
5. 核洗涤（建议）：加入1mL冰冷PBS重悬核沉淀，再次以11,000×g离心5分钟，弃上清，吸干余液。
注：组织样本碎片多，洗涤步骤对纯度至关重要。
6. 核蛋白抽提：向粗核沉淀中加入50 μL提取液EXB（含抑制剂）。在冰上放置30分钟裂解，期间每隔10分钟剧烈涡旋10秒。
7. 收集蛋白：在4℃下以14000×g离心30分钟，收集上清即为细胞核蛋白。
【注意事项】
1. 内参选择：如果您后续要做Western Blot验证，核蛋白内参建议选择 Histone H3、Lamin A/C或PCNA。
2. 交叉污染防控：吸除上清时切勿触及核沉淀；提取核蛋白前务必彻底吸净残余液体，防止胞浆蛋白残留。
3. 全程低温：所有步骤（包括离心、匀浆、涡旋间隙）必须在4°C或冰上进行。
4. 保存建议：提取得到蛋白样本建议小量分装后置于-80℃保存，避免反复冻融。
5. 小量样本：组织量若很少，可使用50mg，所有试剂按比例减半使用。
6. 粘稠度处理：若提取液极其粘稠（DNA释放过多），可适当增加步骤6中的涡旋频率或进行短时间超声处理（如30W, 3s）。
7. 安全防护：请穿实验服并戴一次性手套操作。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-6105、蛋白提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
4℃保存3个月，-20℃保存
常见问题 (FAQ)
提取的蛋白如何保存？
提取后蛋白：小量分装后置于 -80℃ 保存，避免反复冻融（每次冻融损失 5–10% 活性）。
可用于哪些下游应用？
适用：① Western Blot 检测核蛋白（NF-κB p65、c-Myc、HIF-1α、p53 等转录因子）；② EMSA / 凝胶迁移率改变实验；③ 转录因子活性分析（DNA 结合、TransAM 类 ELISA）；④ 核磷酸化蛋白研究（搭配 ES-8136 / ES-8137）；⑤ 染色质相关蛋白研究（搭配超声处理）。
DNA 释放过多导致粘稠怎么办？
粘稠度处理：若提取液极其粘稠（DNA 释放过多），可适当增加涡旋频率或进行短时间超声处理（如 30W, 3 s）。超声处理需冰浴防止温度升高。
核蛋白 WB 内参选择？
内参选择：如果您后续要做 Western Blot 验证，核蛋白内参建议选择 Histone H3、Lamin A/C 或 PCNA。避免：把胞浆 marker（GAPDH、β-actin、Tubulin）当核蛋白内参——它们应在核 fraction 中阴性，反而是胞浆纯度判断的标志物。
抑制剂如何添加？
抑制剂添加（关键）：临用前，向所需体积的 1× LBH 和 EXB 中加入蛋白酶抑制剂（如 ES-8135 蛋白酶抑制剂混合物或 ES-8137 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物），现配现用。注意：含抑制剂的缓冲液不要长期存放，避免抑制剂活性下降。
1× 裂解缓冲液 LBH 如何配置？
1× 裂解缓冲液 LBH 稀释：取 1 mL 的 10× 裂解缓冲液 LBH 加入 9 mL 去离子水，混匀。配置后冰上备用。10× 母液保存于 4℃。
组织流程的关键？
① 切碎洗涤：100 mg 组织 PBS 洗涤 2 次除血污，剪成碎糜状；② 匀浆裂解：加 1,000 µL 1× LBH（含抑制剂），冰浴匀浆直到 >90% 的细胞破碎（取一部分显微镜下观察判断）；③ 沉降细胞核：4℃ 12,000×g 离心 20 min；④ 弃胞浆上清；⑤ 核洗涤（建议）：1 mL 冰冷 PBS 重悬核沉淀，11,000×g 离心 5 min 弃上清吸干余液（说明书强调：组织样本碎片多，洗涤步骤对纯度至关重要）；⑥ 核蛋白抽提：粗核沉淀加 50 µL EXB（含抑制剂），冰上 30 min 裂解（每隔 10 min 剧烈涡旋 10 s）；⑦ 4℃ 14,000×g 离心 30 min，上清=核蛋白。
完整流程参数（培养细胞）？
① 收集：500×g 离心 5 min，预冷 PBS 洗涤 1 次，吸尽上清；② 细胞溶胀（去胞浆）：加 500 µL 1× 裂解缓冲液 LBH（含抑制剂），冰上孵育 15 min 让细胞膨胀破裂；③ 促裂：加 30 µL 裂解缓冲液 CA，立即剧烈涡旋 10 s 使细胞膜彻底破碎释放胞浆；④ 沉降细胞核：4℃ 10,000–12,000×g 离心 1 min；⑤ 核洗涤（可选，提高纯度）：500 µL 冰冷 PBS 重悬，4℃ 10,000–12,000×g 离心 1 min，弃上清——此步骤能显著减少核蛋白中的胞浆残留（如 GAPDH 污染）；⑥ 核蛋白抽提：加 50 µL 提取液缓冲液 EXB（含抑制剂），冰上孵育 30 min（期间每隔 10 min 剧烈涡旋 10 s 辅助核蛋白从染色质上脱落）；⑦ 收集：4℃ 14,000×g 离心 30 min，上清=细胞核蛋白。
起始量？
① 培养细胞：约 10⁶–10⁷ 个细胞（贴壁/悬浮）；② 组织：约 100 mg（小量样本可用 50 mg，所有试剂按比例减半）。贴壁细胞：严禁胰酶消化，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。推荐用刮刀刮下或 EDTA 处理。
本试剂盒的核心特点？
本试剂盒专门用于从培养细胞或组织中提取细胞核蛋白，含三种缓冲液：① 10× 裂解缓冲液 LBH（细胞溶胀去胞浆）；② 裂解缓冲液 CA（促进胞膜彻底破碎）；③ 提取缓冲液 EXB（核蛋白释放）。流程通过分步裂解 + 离心分离的策略，先去除胞浆蛋白，再裂解核膜释放核蛋白。
