EK-6105 细胞/组织核蛋白提取试剂盒

【保存条件】

4℃保存3个月，-20℃保存一年

【实验前准备】

1. 1×裂解缓冲液LBH稀释：取1mL的10×裂解缓冲液LBH加入9mL去离子水，混匀。

2. 抑制剂添加（关键）：临用前，向所需体积的1× LBH和EXB中加入蛋白酶抑制剂（如ES-8315蛋白酶抑制剂混合物Cocktail(通用型, 100×)或ES-8317 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(All-in-one,50×)，现配现用）。

3. 设备预冷：提前开启冷冻离心机至4℃。

【操作步骤】

A.培养细胞核蛋白提取：

1. 细胞收集（起始量：约10⁶–10⁷个细胞）：

贴壁细胞：用预冷PBS洗一遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。500×g离心5分钟收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

悬浮细胞：4℃条件下以500×g离心5分钟收集细胞，期间使用预冷PBS洗涤一次。

2. 细胞溶胀（去胞浆）：将收集的细胞中加入500μL 1×裂解缓冲液LBH（含抑制剂）并在冰上孵育15分钟，让细胞膨胀破裂。

3. 促裂：加入30μL裂解缓冲液CA ，立即剧烈涡旋10秒，使细胞膜彻底破碎释放胞浆。

4. 沉降细胞核：在4℃下以10,000–12,000×g立即离心1分钟。

5. 核洗涤（可选，提高纯度）： 向核沉淀中加入500 μL冰冷PBS，轻轻颠倒混匀，4℃下 10,000–12,000×g离心1分钟，弃上清。

注：此步骤能显著减少核蛋白中的胞浆残留（如GAPDH污染）。

6. 核蛋白抽提：向核沉淀中加入50 μL提取液缓冲液EXB（含抑制剂）。冰上孵育30分钟。期间每隔10分钟剧烈涡旋10秒，辅助核蛋白从染色质上脱落。

7. 收集：在4℃下以14000×g离心30分钟，收集上清即为细胞核蛋白。

B. 组织中提取核蛋白（起始量：约100mg）：

1. 切碎洗涤：取100mg组织，PBS洗涤2次除去血污，剪成碎糜状。

2. 匀浆裂解：加入1,000 μL 1×LBH（含抑制剂），置于预冷的匀浆器中冰浴匀浆。低温匀浆组织直到>90%的细胞破碎，可取一部分于显微镜下观察判断。

3. 沉降细胞核：4℃下，12,000×g离心20分钟。

4. 弃胞浆：丢弃上清液。

5. 核洗涤（建议）：加入1mL冰冷PBS重悬核沉淀，再次以11,000×g离心5分钟，弃上清，吸干余液。

注：组织样本碎片多，洗涤步骤对纯度至关重要。

6. 核蛋白抽提：向粗核沉淀中加入50 μL提取液EXB（含抑制剂）。在冰上放置30分钟裂解，期间每隔10分钟剧烈涡旋10秒。

7. 收集蛋白：在4℃下以14000×g离心30分钟，收集上清即为细胞核蛋白。

【注意事项】

1. 内参选择：如果您后续要做Western Blot验证，核蛋白内参建议选择 Histone H3、Lamin A/C或PCNA。

2. 交叉污染防控：吸除上清时切勿触及核沉淀；提取核蛋白前务必彻底吸净残余液体，防止胞浆蛋白残留。

3. 全程低温：所有步骤（包括离心、匀浆、涡旋间隙）必须在4°C或冰上进行。

4. 保存建议：提取得到蛋白样本建议小量分装后置于-80℃保存，避免反复冻融。

5. 小量样本：组织量若很少，可使用50mg，所有试剂按比例减半使用。

6. 粘稠度处理：若提取液极其粘稠（DNA释放过多），可适当增加步骤6中的涡旋频率或进行短时间超声处理（如30W, 3s）。

7. 安全防护：请穿实验服并戴一次性手套操作。