EK-5001 BCA 蛋白定量试剂盒

【保存条件】

室温避光保存，有效期12个月

【概述】

BCA 法是实验室最常用的蛋白定量方法之一。其原理是在碱性条件下，蛋白将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂结合形成紫色的络合物，在562 nm处有强吸收峰。

高灵敏度：检出限低至25 μg/mL。

高兼容性：可兼容 5% 浓度的 SDS、Triton X-100、Tween 20/80。

干扰因素：BCA技术对螯合剂（EDTA > 10mM）和还原剂（DTT > 1mM、β-ME > 0.01%）敏感。若还原剂超标，建议改用EK-5004 Bradford蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）。

【使用方法】

1. 准备BCA工作液 (Working Reagent)

配制：按50:1的比例混合A液与B液（例如：5 mL A 液 + 100 μL B 液）。

观察：若A液有结晶析出，请37℃水浴溶解后使用。混匀后的工作液应为苹果绿色，室温24小时内稳定。

2. 蛋白标准曲线的建立 (微孔板法)

建议使用与待测样品相同的缓冲液（如PBS、0.9% NaCl）稀释标准品。

3. 蛋白浓度的检测

①　加样：向 96 孔板中加入5 μL 标准品或待测样品。(若样品体积不足 5 μL，请用稀释液补足)

②　显色：每孔加入 195 μL BCA 工作液，轻晃混匀。

③　孵育：37℃放置30分钟（标准法）。

注：低浓度蛋白可60℃孵育 30min；普通定性可室温孵育 2h。

④　测定：冷却至室温，使用酶标仪测定562 nm（或540-595 nm之间）的吸光度。

4. 数据计算

①　绘图：以标准品浓度为横坐标 (X)，吸光度OD$值为纵坐标 (Y)，绘制标准曲线。

②　计算：根据样品的OD值（多孔则为平均OD）在曲线上计算对应浓度（若样品有稀释则留意最后乘以稀释倍数）。

例：公式Y = 0.4995X + 0.4151，若测得样品OD=0.6，则浓度X = (0.6 - 0.4151) / 0.4995 = 0.37 mg/mL。

【注意事项】

1. 显色时间控制：BCA反应不是“终点反应”，颜色会随时间加深。 
优化：标准品和样品必须同时加液、同时孵育、同时读数，以确保数据的可比性。

2. 耗材选择：请使用底部透明的平底96孔板（如普通细胞培养板）。若背景值异常升高，请检查稀释液本身是否含有强还原剂（如高浓度 DTT）。

3. 波长建议：建议使用最优562nm，若无此滤光片，可选择540-590nm范围。

4. 安全防护：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。