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【保存条件】
-20 ℃保存，有效期12个月
【概述】
本产品专为单链寡核苷酸（Oligo）的杂交退火设计，适用于-5-500 bp的DNA片段。
l 核心优势：特别优化了针对RNAi (shRNA)和CRISPR (gRNA) 载体构建中复杂序列的退火效果。由于此类序列常含有约20 bp的互补回文序列，极易形成内部发夹结构；本缓冲液能有效抑制自身折叠，诱导两条Oligo正确配对。
l 应用场景：退火产物可直接用于经酶切、纯化的质粒连接反应，转化效率高，阳性克隆比例大。
【操作方法】
I．体系配制（如下20 µl体系为例）
Reagent试剂 | Amount 试剂量 |
正链Oligo(10μM) 负链Oligo(10μM) ddH2O Annealing Buffer(10x) | 5μl 5μl 8 μl 2μl |
20μl |
II. 退火条件
方式A：PCR 仪程序（进阶方案，推荐）
Cycles | Temperature | Time | ||
Simple Protocol 简易步骤 | Step 1: | 1 | 95°C | 5 min |
Step 2: | 70 | 95°C (-1°C/cycle ) | 1 min | |
Step 3: | 4°C | HOLD | ||
Cycles | Temperature | Time | ||
Advanced Protocol 进阶操作步骤 （以Tm值55°C为例） | Step 1: | 1 | 95°C | 5 min |
Step 2: | 40* | 95°C (-1°C/cycle ) | 1 min | |
Step 3: | 1 | 55°C | 30min | |
Step 4: | 20 | 55°C* (-1°C/cycle ) | 1min | |
Step 5: | 4°C | HOLD |
*步骤2和4中的循环数取决于要退火的寡核苷酸的Tm。
方式 B：传统水浴/干浴法（简易方案）
1．将混合好的离心管置于95°C 加热模块或水浴锅中。
2．保持95°C孵育5 min。
3．关闭电源，将离心管留在模块/水浴中，使其随温自然冷却至室温（通常需1-2小时）。
注：冷却至室温前切勿中途取出或直接放入冰上，骤降温会导致大量错配或发夹形成。
【注意事项】
1. Oligo 纯度：建议使用经过 PAGE 纯化更高方式纯化的Oli go（更高纯度决定成功概率），杂质可能会降低退火效率。
2. 浓度匹配：为获得最高比例的双链片段，正负链应严格按照 1:1 摩尔比混合。
3. 稀释建议：退火后的双链 Oligo 浓度较高（本体系为2.5 μM），在与质粒连接前，通常需要用 ddH2O或1× Annealing Buffer稀释10-100倍。
4. 安全防护：仅限科研使用。操作时请穿戴实验服、一次性手套和口罩。
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