ED-8482 Ellman’s Reagent (DNTB,pH 8.0)

【保存条件】 

4ºC保存，有效期一年。Ellman's Reagent与Cysteine Hydrochloride Monohydrate溶解后-20ºC保存。

【操作步骤】 

预先准备：

5×Buffer RB稀释：取100ml 5×Buffer RB加入400ml去离子水稀释至1×Buffer RB备用。

Ellman's Reagent试剂溶液：将40mg Ellman's Reagent试剂溶解在10mL 1×Buffer RB中。

1. 通过将以下浓度的Cysteine Hydrochloride Monohydrate（盐酸半胱氨酸一水合物）溶解在反应缓冲液1×Buffer RB中来制备一组半胱氨酸标准品(根据不同实验要求选择不同标准品及体系)：

2. 准备一组试管，每个试管含有50μl Ellman Reagent试剂溶液和2.5ml反应缓冲液1×Buffer RB。

3. 将250μL的每种标准品或待测物加入步骤2中制备的单独试管中，总体积2.8ml。

注意：对于未知物进行稀释，使应用于测定反应的250μL样品在标准曲线的工作范围内具有巯基浓度（0.1-1.0mM是理想的）。

4. 混合并在室温下孵育15分钟。

5. 测量412nm处的吸光度。

6. 绘制为标准品获得的值以生成标准曲线。从该曲线确定实验样品浓度。

计算示例：使用1cm分光光度比色皿将250μL未知物等分试样与2.5mL反应缓冲液1×Buffer RB和50μL Ellman Reagent试剂溶液混合，得到0.879的吸光度（减去空白后）。计算巯基浓度，单位为μmol/mL未知物。已知TNB在412nm处的缓冲系统中的摩尔吸收率（摩尔消光系数，以M^-1cm^-1为单位表示）为14,150。

 A = 吸光度，b =以厘米为单位的比色皿长度，c = 以摩尔/升为单位的浓度（=M）

求解浓度公式为：c=A/bE

本例中：A = 0.879，b = 1cm，Ε = 14,150M^-1cm^-1。因此，c = 0.879 /(1×14,150)= 6.21×10⁻⁵M

如果检测浓度为：6.21×10⁻⁵M，则2.8ml溶液中含有：2.8×10^-3L×( 6.21×10⁻⁵moles/L)=1.74 ×10⁻⁷ moles.

测定溶液中这些 1.74 x 10^-7 摩尔的巯基是由原始的0.25mL样品贡献的。因此，原始未知样品中游离巯基的浓度为：

(1.74 ×10⁻⁷moles)/(0.25×10⁻³L) 1000mL = 6.96 ×10⁻⁴ M

【参考文献】 

Riddles, P.W., et al. (1979) Ellman’s reagent: 5, 5 ́-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Anal Biochem 94:75-81.

Kuwata, K., et al. (1982) Liquid chromatographic determination of alkylthiols via derivatization with 5, 5’- dithiobis(2-nitrobenzoic acid). Anal Chem 54:1082-7.

Masamune, S, et al. (1989) Bio-Claisen condensation catalyzed by thiolase from Zoogloea ramigera. Active site cysteine residues. Chemtracts- Organic Chem 2:247-51.