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产品介绍
本试剂盒采用高效的RNAEx ZOL裂解技术结合硅胶膜吸附工艺，可从动物组织、细胞及细菌等样本中快速提取高质量的微小RNA（miRNA）。该系统通过相分离技术去除大部分基因组DNA和蛋白质，随后通过高浓度乙醇调节，使miRNA选择性结合于吸附柱上。纯化后的miRNA可直接用于Northern Blot、Real-Time PCR及测序等实验。
存储条件
室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
1. 无水乙醇（96%-100%）
2. 无RNase酶的1.5mL离心管
3. 无RNase酶的吸头
4. 干净的手套
5. 高速离心机
6. 物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1. Buffer RWT作为浓缩液提供可能会形成沉淀，如果有沉淀出现请37℃加热溶解后室温使用。在第一次使用前加入2倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
2. Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
3. RNase-Free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
4. RNA在RNAEx ZOL中短时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。
操作步骤：
1. 请根据样品种类进行以下步骤（1a为动物细胞，1b为动物组织）
1a. 收集动物细胞：悬浮细胞可直接300×g离心5min并仔细吸除上清留沉淀待使用；单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，进行步骤2裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用PBS清洗细胞，吸除PBS后使用含0.10%-0.25%胰酶的PBS使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失活后转入1.5mL无酶离心管中300×g离心5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集细胞数量不要超过1×107，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，否则会导致步骤2时细胞裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，导致RNA的产量降低。
1b. 动物组织匀浆裂解处理：将10mg-30mg动物组织转移入1.5mL无酶离心管中并加入700μL RNAEx ZOL（动物组织量不要超过30mg），使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。直接进行步骤3.
匀浆时间根据样本裂解难易程度决定，亦可匀浆后静置3-5min延长裂解时间（期间颠倒吹匀2-3次）。
2. 样品裂解：对于1a中使用直接裂解法的细胞应在培养皿或培养瓶中直接加入700μL RNAEx ZOL破碎细胞，涡旋或吹匀混合。将裂解液移入无酶1.5mL离心管中。涡旋或移液器混合并确保没有细胞团块可见。
细胞沉淀不完全松动吹匀可能会导致裂解效率低下和miRNA产量降低。一般≤3×106个细胞若细胞量较大，可涡旋后静置3-5min延长裂解时间（期间颠倒吹匀2-3次）。若不能及时提取，裂解后溶液可至于-80℃储存3-6个月。
3. 将含裂解物离心管置于室温静置5min.
该步骤促进核蛋白复合物的解离。
4. 向含裂解物离心管中加入140μL Solution CH, 用力摇动或涡旋15s。
彻底混合对于随后的相分离很重要。
5. 将离心管置于室温静置2-3min.
6. 在4°C下以 12,000×g离心15min。
离心后，样品分为3相：上层含有miRNA的无色水相；白色的相间和较低的红色有机相。上层水相的体积应约为 350μL。
7. 将上层水相转移到新的无酶1.5mL离心管中，加入约1.5倍体积（通常为525μL）无水乙醇，移液器吹打彻底混匀。不要离心，立即进行下一步骤。
加入乙醇后可能会形成沉淀，为正常现象，不会影响提取过程和结果。
8. 将上一步骤混匀后的溶液约700μL转移入RNA吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000×g(≥10,000 rpm)室温下离心30s，弃废液。
吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。
9. 向吸附柱中加入700μL Buffer RWT（使用前请确认Buffer RWT是否按要求加入2倍体积无水乙醇）, ≥8000×g(≥10,000 rpm)室温下离心30s，弃废液。
10. 向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE是否按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。
11. 重复步骤10一次。
12. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。
13. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL 离心管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
14. 向吸附柱膜正中央加入50-100μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到miRNA溶液。
RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。
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