产品描述
产品介绍
本试剂盒采用高效的RNAEx ZOL裂解技术结合硅胶膜吸附工艺，可从动物组织、细胞及细菌等样本中快速提取高质量的微小RNA（miRNA）。该系统通过相分离技术去除大部分基因组DNA和蛋白质，随后通过高浓度乙醇调节，使miRNA选择性结合于吸附柱上。纯化后的miRNA可直接用于Northern Blot、Real-Time PCR及测序等实验。
存储条件
室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
1. 无水乙醇（96%-100%）
2. 无RNase酶的1.5mL离心管
3. 无RNase酶的吸头
4. 干净的手套
5. 高速离心机
6. 物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1. Buffer RWT作为浓缩液提供可能会形成沉淀，如果有沉淀出现请37℃加热溶解后室温使用。在第一次使用前加入2倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
2. Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
3. RNase-Free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
4. RNA在RNAEx ZOL中短时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。
操作步骤：
1. 请根据样品种类进行以下步骤（1a为动物细胞，1b为动物组织）
1a. 收集动物细胞：悬浮细胞可直接300×g离心5min并仔细吸除上清留沉淀待使用；单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，进行步骤2裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用PBS清洗细胞，吸除PBS后使用含0.10%-0.25%胰酶的PBS使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失活后转入1.5mL无酶离心管中300×g离心5min，吸除上清留沉淀待使用）
注意：收集细胞数量不要超过1×107，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，否则会导致步骤2时细胞裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，导致RNA的产量降低。
1b. 动物组织匀浆裂解处理：将10mg-30mg动物组织转移入1.5mL无酶离心管中并加入700μL RNAEx ZOL（动物组织量不要超过30mg），使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。直接进行步骤3.
匀浆时间根据样本裂解难易程度决定，亦可匀浆后静置3-5min延长裂解时间（期间颠倒吹匀2-3次）。
2. 样品裂解：对于1a中使用直接裂解法的细胞应在培养皿或培养瓶中直接加入700μL RNAEx ZOL破碎细胞，涡旋或吹匀混合。将裂解液移入无酶1.5mL离心管中。涡旋或移液器混合并确保没有细胞团块可见。
细胞沉淀不完全松动吹匀可能会导致裂解效率低下和miRNA产量降低。一般≤3×106个细胞若细胞量较大，可涡旋后静置3-5min延长裂解时间（期间颠倒吹匀2-3次）。若不能及时提取，裂解后溶液可至于-80℃储存3-6个月。
3. 将含裂解物离心管置于室温静置5min.
该步骤促进核蛋白复合物的解离。
4. 向含裂解物离心管中加入140μL Solution CH, 用力摇动或涡旋15s。
彻底混合对于随后的相分离很重要。
5. 将离心管置于室温静置2-3min.
6. 在4°C下以 12,000×g离心15min。
离心后，样品分为3相：上层含有miRNA的无色水相；白色的相间和较低的红色有机相。上层水相的体积应约为 350μL。
7. 将上层水相转移到新的无酶1.5mL离心管中，加入约1.5倍体积（通常为525μL）无水乙醇，移液器吹打彻底混匀。不要离心，立即进行下一步骤。
加入乙醇后可能会形成沉淀，为正常现象，不会影响提取过程和结果。
8. 将上一步骤混匀后的溶液约700μL转移入RNA吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000×g(≥10,000 rpm)室温下离心30s，弃废液。
吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。
9. 向吸附柱中加入700μL Buffer RWT（使用前请确认Buffer RWT是否按要求加入2倍体积无水乙醇）, ≥8000×g(≥10,000 rpm)室温下离心30s，弃废液。
10. 向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE是否按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。
11. 重复步骤10一次。
12. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。
13. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL 离心管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
14. 向吸附柱膜正中央加入50-100μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到miRNA溶液。
RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1316、RNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 miRNA 应如何保存？
短期 -20℃（1 周内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份），避免反复冻融。重要样品建议双管 -80℃ 双备份。
与普通 RNA 试剂盒（EK-1300/1303）相比怎么选？
EK-1300/1303（普通柱法）：保留 ≥200 nt RNA，丢失大部分小 RNA，但对常规 mRNA 表达分析足够；EK-1316（含小 RNA）：同时保留大小 RNA。选择依据：① 仅做 mRNA 分析 → EK-1303（更经济、无苯酚）或 EK-1300（含 ZOL 工艺）；② 同时分析 miRNA 与 mRNA → EK-1316；③ 仅做 miRNA → EK-1316（或专用 miRNA 流程）。
可以用于哪些下游应用？
纯化后的 miRNA 可直接用于 Northern Blot、Real-Time PCR 及测序等实验。扩展：① miRNA qRT-PCR（茎环法或 polyA 加尾法）；② 小 RNA 测序 sRNA-seq（建议起始量 ≥500 ng 总 RNA）；③ miRNA 微阵列（Affymetrix miRNA、Agilent miRNA 类芯片）；④ miRNA 体外靶基因验证（双荧光素酶报告）；⑤ piRNA / tRF 等其他 sRNA 研究。
A260/A280 与浓度测量需要注意什么？
含 miRNA 的总 RNA 在 NanoDrop 测量时 OD260/OD280 应 ≥1.8。注意：① 短链小 RNA（<25 nt）NanoDrop 测量灵敏度偏低，浓度 <10 ng/µL 时建议用 Qubit miRNA 检测；② 测量浓度对小 RNA 文库构建至关重要，建议同时用两种方法（NanoDrop 测总 RNA + Qubit 小 RNA 专用 kit 测 miRNA fraction）；③ 同一 RNA 样品在水中测得的 OD260/OD280 可能比在 Tris pH 7.5 中偏低，但不代表 RNA 不纯。
分相步骤的关键？
① 加 140 µL Solution CH 涡旋 15 s；② 室温静置 2–3 min；③ 4℃ 12,000×g 离心 15 min；④ 上层无色水相约 350 µL；⑤ 加 1.5 倍体积（约 525 µL）无水乙醇 移液器吹打彻底混匀（不要离心，立即上柱）。
与 EK-1300（普通 RNAex ZOL 柱法）相比的关键差异？
关键差异在乙醇浓度：① EK-1300：水相加等体积无水乙醇（≈350 µL）后上柱，结合较短小 RNA 效率低；② EK-1316：水相加约 1.5 倍体积无水乙醇（≈525 µL）后上柱，乙醇浓度提高到 65–70%，让 18 nt 起的小 RNA 都能结合膜。关键漂洗：EK-1316 用 Buffer RWT 替代 Buffer RW1（Buffer RWT 第一次使用前加 2 倍体积乙醇，Buffer RW1 是 0.25 倍体积乙醇）。
典型得率？
总 RNA 得率：与 EK-1300 相当（培养细胞 1×10⁶ 约 5–15 µg；组织 30 mg 约 30–150 µg）。小 RNA 得率：占总 RNA 5–15%，即 0.3–2 µg miRNA / 1×10⁶ 细胞。具体 miRNA 含量受细胞类型影响（造血细胞、肌肉细胞 miRNA 占比偏高）。
适用哪些样品？
① 动物细胞（≤1×10⁷，加 700 µL RNAEx ZOL 裂解）；② 动物组织（10–30 mg，加 700 µL RNAEx ZOL 研磨匀浆）。说明书提示：可从动物组织、细胞及细菌等样本中快速提取高质量的微小 RNA（miRNA）。不推荐：血清/血浆（请用 EK-1318 / EK-1320）；外泌体源 miRNA（请用 EK-1322）。每个样品可同时获得总 RNA + 小 RNA。
本试剂盒针对小 RNA 有什么特殊设计？
普通 RNA 提取试剂盒的硅胶膜结合条件以保留 ≥200 nt RNA 为主，会丢失大部分小 RNA。本试剂盒采用「RNAEx ZOL 裂解 + Solution CH 助分相 + 1.5 倍体积乙醇调节结合条件 + Buffer RWT 漂洗 + Buffer RPE 漂洗」工艺，让 18 nt 起的小 RNA（miRNA、piRNA、siRNA、tRF 等）能与大 RNA 一同结合柱并保留。
