EK-1315 FastPure细胞质和细胞核RNA提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从哺乳动物细胞或组织中提取细胞质或细胞核RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

Buffer RN收到后置于2-8℃保存；Buffer RT可室温（15℃-25℃）干燥放置至少一年；其他试剂室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

1. 14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为14.3 M)或2M DTT

2. 70%乙醇：RNase-Free水配制

3. 无水乙醇（96%-100%）

4. 无酶1.5ml离心管

5. 无酶吸头

6. 干净的手套

7.  物理研磨设备

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

1. 操作前在Buffer RN中加入β-巯基乙醇（β-ME）至终浓度为1%（建议现配现用），如1 ml Buffer RN中加入10μl β-巯基乙醇(或加入20 µl的2 M DTT)，每次使用前取部分配置。

2. Buffer RT在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。

3. Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

4. Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

5. RNase-Free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。

6. RNA在Buffer RT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的离心管或玻璃器皿。

7. RNA提取操作及离心过程室温进行即可。

操作步骤：

1. 请根据样品种类进行以下步骤（1a为动物细胞，1b为动物组织）

1a. 收集动物细胞：悬浮细胞可直接300×g离心5min并仔细吸除上清留沉淀待使用；单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，待步骤2用Buffer RN裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用PBS清洗细胞，吸除PBS后使用含0.10%-0.25%胰酶使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失活后转入无酶1.5ml离心管中300×g离心5min，吸除上清留沉淀待使用）

注意：收集细胞数量不要超过1×10⁷，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，可使用PBS清洗1-2次，否则会导致步骤2时细胞裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，RNA的产量降低。

1b. 动物组织匀浆处理：将5mg-15mg动物组织转移入无酶1.5ml离心管中并加入200μl Buffer RN（动物组织量不要超过15mg）使用前请检查Buffer RN是否加入β-巯基乙醇，使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。使用移液器将裂解物转移到无酶离心管中。在台式离心机中以最大速度离心裂解物10min，离心后将上清（即细胞质RNA）转移至新的无酶管中，沉淀用于核RNA提取。进行步骤4.

2. 加入4℃预冷的180μl Buffer RN(使用前请检查Buffer RN是否加入β-巯基乙醇或DTT)至细胞沉淀中，并于冰上孵育5min。对于未消化收集的培养在3.5cm培养皿中的细胞，可吸净培养基用PBS清洗一次后，直接加入4℃预冷的180μl Buffer RN至细胞培养皿中，然后用细胞刮刀轻轻刮动并转移至无酶1.5ml离心管中，并于冰上孵育5min。

对于提前离心沉淀在离心管中的细胞，通过轻弹离心管以使细胞沉淀彻底分散开。悬浮液应迅速澄清，表明质膜立即溶解。注意：细胞沉淀的不完全分散可能导致裂解效率低下和RNA产量降低。

3. 将上述裂解物在4ºC下以300×g离心2min。将上清液转移到新的无酶1.5ml离心管中用于细胞质RNA提取，沉淀用于细胞核RNA提取。如果在此过程的后续步骤中使用相同的离心机，则保持离心室温状态。

上清液含有细胞质提取物。 根据细胞类型的不同，它通常略带混浊和黄白色。 沉淀含有细胞核，上清中为细胞质裂解物。

4. 于步骤3中所得细胞质裂解物及细胞沉淀管中分别加入600 µl Buffer RT，充分涡旋混匀。

若沉淀物较多，可室温裂解3-5min，期间摇匀2-3次。

5. 将430μl无水乙醇（96–100％）分别加入两管裂解物中，并用移液器将其充分混合。不要离心。

注意：从某些细胞系纯化RNA时，加入乙醇后可能会出现沉淀。 这不会影响后续提取过程。

6. 将步骤5混匀后的两管溶液转移入无酶吸附柱中并套上2ml收集管，≥8000×g（≥10,000rpm）离心1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。

吸附柱最大上柱量为700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2ml收集管中。

7. 向两个吸附柱中分别加入700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

8. 将两个吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μl Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

9. 重复步骤8一次。

10. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱子。

11. 将两个吸附柱分别套入新的RNase-Free的1.5ml 离心管中，并置于无RNA酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。

若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。

12. 向两个吸附柱膜正中央分别加入30-50μl RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到RNA溶液。