产品描述
产品介绍
本试剂盒可以快速地从FFPE石蜡切片中提取RNA，不含酚氯仿等有毒试剂，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
二甲苯（或相应脱蜡液）
无水乙醇（96%-100%）
无酶1.5mL离心管
无酶吸头
干净的手套
高速离心机
物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
Buffer TLB在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请37-70℃加热溶解后室温使用。
Buffer WB I作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
Buffer WB II作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
RNA提取操作及离心过程室温进行即可。
操作步骤：
1. 样本处理
a. 石蜡切片：取5-8张石蜡切片，每张厚度为5-10μm，尺寸为1×1cm。
b. 石蜡块：使用手术刀刮取约30mg的组织样本（尽量去除多余的石蜡）。注意：如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2~3片弃掉不用。
c. 福尔马林等固定液中的样本：取30mg样本，用手术刀切成数块，置于1.5mL离心管中，加入500μL 1×PBS，涡旋振荡混匀，以13,000×g（约13,400×g）室温离心1min。弃去上清，重复此步骤3次。
2. 将石蜡切片或石蜡块切片放入1.5或2mL微量离心管中，并向样品中加入0.8mL二甲苯。盖紧管盖后充分混匀并室温孵育5分钟，期间需多次手动进行颠倒混匀。
3. 孵育结束后，直接向管中补加400μL无水乙醇 并剧烈震荡 10 s。
4. 在室温（15-25°C）下以13,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。
5. 向沉淀中加入1mL无水乙醇，并通过涡旋混合约10s。
6. 在室温（15-25°C）下以13,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。
建议使用细枪头小心吸尽残留液体，或将离心管在干净纸巾上轻轻扣干，以最大限度去除乙醇残留。
7. 打开离心管盖，将离心管置于55°C金属浴或烘箱中干燥10min（或直至乙醇完全挥发，组织沉淀呈干燥状态）。
8. 向干燥后的样本管中加入100μL Buffer TLB，16μL 10%SDS和40μL蛋白酶K溶液。每隔几次短暂涡旋，后在55°C下孵育过夜（或2-4小时）。
9. 加入325μL Buffer B1和325μL无水乙醇，上下颠倒轻轻混合。
10. 将上述步骤混匀后的溶液转移入无酶吸附柱中并套上2mL收集管，≥12000×g（≥12,000rpm）离心1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。
吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。
11. 向吸附柱中分别加入500μL Buffer WB I（使用前请确认Buffer WBI按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
12. 将两个吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer WBII（使用前请确认Buffer WBII按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
13. 重复步骤12一次。
14. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱子。
15. 将两个吸附柱分别套入新的RNase-free的1.5mL 离心管中，并置于无RNA酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
16. 向两个吸附柱膜正中央分别加入30-50μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到RNA溶液。
注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。为了提高RNA的回收量，可将RNase-Free Water加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1312、RNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 RNA 应如何保存？
短期：-20℃（≤1 周）。长期：-80℃ 分装储存（每管单次用量）。FFPE RNA 因本身高度断裂，反复冻融后片段长度还会进一步下降，强烈建议按下游应用预分装。储存 >6 个月样品在使用前重新 Qubit 测浓度并跑 TapeStation 评估 DV200；NGS 文库构建用样品建议 -80℃ 母液 + 工作液 -20℃ 短期使用。
哪些样品类型不适合？
不适合：① 酸性甲醛固定或储存条件差的样品（RNA 严重降解，DV200 <10%）；② 储存 >20 年的极陈旧样品（成功率低）；③ 含大量黑色素或铁血黄素的组织（PCR 抑制严重）；④ 冷冻组织（请用 EK-1303）；⑤ 新鲜组织（请用 EK-1303 或 EK-1300）。
从 LCM 微切割小切片如何提取？
微量样品（<100 cells、<5 mm² 组织）建议：① 减小裂解液体积至 50 μL；② 蛋白酶 K 高温消化时间延长至 4–16 小时；③ 减小洗脱体积至 15–20 μL。
可以用于哪些下游应用？
适合的应用：① 靶向基因表达谱（NanoString、qRT-PCR），FFPE 样品的主要应用；② RNA-seq 短读长（建议 RNA-seq 文库，DV200 ≥30%）；③ 靶向扩增子测序（如肿瘤融合基因检测）；④ miRNA 分析（小 RNA 在 FFPE 中相对稳定）。不适合：长读长 RNA-seq、isoform-level 分析、全长 mRNA 测序。
去交联步骤的关键参数？
甲醛-RNA 加合物（主要是单亚甲基桥）的逆转条件：本试剂盒推荐 80℃ × 15–30 分钟（视样品损伤程度延长）。注意：① 温度过高（>90℃）会加重 RNA 断裂；② 时间过长（>60 分钟）反而降低得率；③ 蛋白酶 K 用量需充足（约 200 μg/mL），保证蛋白彻底消化释放出共价结合的 RNA。
脱蜡步骤如何选择？
二甲苯：经典高效，但有毒、需通风柜操作；矿物油：与二甲苯效果相当但更安全无毒（80℃ 5 分钟）；加热融蜡：石蜡残留较多，影响柱结合，不推荐。本试剂盒兼容前两种。重要：脱蜡后必须用 100% 乙醇彻底洗涤，去除残余溶剂，否则会抑制蛋白酶 K 活性。
典型起始量与得率？
推荐起始量：5–10 μm 厚切片 2–5 张（约 20–40 mg 组织）。典型得率：① 新鲜 FFPE 块（<1 年储存）：1–10 μg RNA；② 储存 1–5 年：0.5–5 μg；③ 储存 >10 年：0.1–2 μg。质量评估指标：RIN 已不适用（FFPE RNA 普遍 RIN <3），改用 DV200（>200 nt 片段占比）— DV200 ≥30% 适合 NGS，≥70% 为高质量。
FFPE 样品的 RNA 为什么质量普遍较差？
FFPE 样品（formalin-fixed paraffin-embedded，福尔马林固定石蜡包埋）面临的挑战：① 甲醛交联使 RNA 与蛋白共价结合，需高温去交联；② RNA 严重水解：储存数年后 RNA 片段长度多在 100–500 nt（与新鲜组织 RNA >2000 nt 相比）；③ 石蜡阻隔裂解液接触组织。本试剂盒采用「脱蜡 + 蛋白酶 K 高温去交联 + 柱法纯化」专用流程，最大程度回收降解片段化的 RNA。
