EK-1312 FastPure FFPE石蜡切片RNA提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从FFPE石蜡切片中提取RNA，不含酚氯仿等有毒试剂，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

 二甲苯（或相应脱蜡液）

 无水乙醇（96%-100%）

无酶1.5mL离心管

无酶吸头

干净的手套

高速离心机

物理研磨设备

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

 Buffer TLB在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请37-70℃加热溶解后室温使用。

 Buffer WB I作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

 Buffer WB II作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

 RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。

 RNA提取操作及离心过程室温进行即可。

操作步骤：

1. 样本处理

a. 石蜡切片：取5-8张石蜡切片，每张厚度为5-10μm，尺寸为1×1cm。

b. 石蜡块：使用手术刀刮取约30mg的组织样本（尽量去除多余的石蜡）。注意：如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2~3片弃掉不用。

c. 福尔马林等固定液中的样本：取30mg样本，用手术刀切成数块，置于1.5mL离心管中，加入500μL 1×PBS，涡旋振荡混匀，以13,000×g（约13,400×g）室温离心1min。弃去上清，重复此步骤3次。

2. 将石蜡切片或石蜡块切片放入1.5或2mL微量离心管中，并向样品中加入0.8mL二甲苯。盖紧管盖后充分混匀并室温孵育5分钟，期间需多次手动进行颠倒混匀。

3. 孵育结束后，直接向管中补加400μL无水乙醇 并剧烈震荡 10 s。

4. 在室温（15-25°C）下以13,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。

5. 向沉淀中加入1mL无水乙醇，并通过涡旋混合约10s。

6. 在室温（15-25°C）下以13,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。

建议使用细枪头小心吸尽残留液体，或将离心管在干净纸巾上轻轻扣干，以最大限度去除乙醇残留。

7. 打开离心管盖，将离心管置于55°C金属浴或烘箱中干燥10min（或直至乙醇完全挥发，组织沉淀呈干燥状态）。

8. 向干燥后的样本管中加入100μL Buffer TLB，16μL 10%SDS和40μL蛋白酶K溶液。每隔几次短暂涡旋，后在55°C下孵育过夜（或2-4小时）。

9. 加入325μL Buffer B1和325μL无水乙醇，上下颠倒轻轻混合。

10. 将上述步骤混匀后的溶液转移入无酶吸附柱中并套上2mL收集管，≥12000×g（≥12,000rpm）离心1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。

吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。

11. 向吸附柱中分别加入500μL Buffer WB I（使用前请确认Buffer WBI按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

12. 将两个吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer WBII（使用前请确认Buffer WBII按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

13. 重复步骤12一次。

14. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱子。

15. 将两个吸附柱分别套入新的RNase-free的1.5mL 离心管中，并置于无RNA酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。

若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。

16. 向两个吸附柱膜正中央分别加入30-50μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到RNA溶液。

注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。为了提高RNA的回收量，可将RNase-Free Water加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。