产品描述
产品介绍
本试剂盒可以快速地从革兰氏阴性及阳性菌（≤5×108 Cells）中提取总RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、引物延伸分析、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
Lysozyme Solution置于-20℃保存，其他试剂室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为14.3 M)或2M DTT溶液
70%乙醇：RNase-Free水配制
无水乙醇（96%-100%）
无酶1.5mL离心管
无酶吸头
干净的手套
高速离心机
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
操作前在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（β-ME）至终浓度为1%（建议现配现用），如1 mL Buffer RLT中加入10μL β-巯基乙醇（或20μL 2M DTT溶液）。配好的Buffer RLT可在4℃维持稳定一个月。
Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。
Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
RNase-Free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。
RNA提取操作及离心过程室温进行即可。
操作步骤：
1. 取适量菌液于离心机中室温5,000×g离心10min收集革兰氏阴性或者阳性细菌样品（≤5×108 Cells）。
若需要处理更多细菌，则相应增加后续各种试剂用量。
2. 倒弃培养基，在吸水纸轻轻拍打除尽残液（或用吸头吸尽）
3. 加入100μL Lysozyme Solution，通过上下吹打数次小心地重悬沉淀。
若细菌量较大可按细菌量加倍加入溶菌酶的Buffer TE，后续Buffer RLT也要相应增加体积。
4. 涡旋混匀10s，37°C下孵育10min。在孵育过程中，至少每2min涡旋10s混匀。
5. 加入350μL Buffer RLT（使用前请检查Buffer RLT是否加入β-巯基乙醇或DTT）并剧烈振荡。如果可见颗粒物质，通过离心将其沉淀，取上清液备用。
6. 添加250μL体积的无水乙醇于步骤5的上清溶液中，通过移液混匀，不要离心。
加入乙醇后可能会形成沉淀为正常现象，这不会影响后续的操作步骤。
7. 将步骤6混匀后的溶液转移入RNase-Free吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。
吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。
8. 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1（使用前请确按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
9. 将吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
10. 重复操作步骤9一次。
11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱子。
12. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL 离心管中，并置于无酶环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
13. 向吸附柱膜正中央加入50-100μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置2-3 min。后置于最大转速(~13,400×g)离心3min得到RNA溶液。
RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应立即进行下游实验或置于-80℃储存。
常见问题：
1. 柱子堵塞
样品用量太多:减少样品用量，参照说明书中提供用量建议。
样品消化不充分:增加Lysozyme Solution用量，延长酶消化孵育时间。
2. RNA产量低
试剂准备有误：Buffer RPE没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。
洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。
3. RNA降解严重
样品保存有误：非新鲜现取样品应尽量保存RNA Holder等保存液中。
提取过程耗材及环境污染：提取中使用的吸头、离心管等需经无酶处理，环境应尽量选择无酶环境或洁净环境以减少RNase的影响。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1310、RNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
-20℃保存，其他试剂室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
低生物量样品如何提高检出率？
低生物量样品（1×10⁵–1×10⁶ 细胞）建议：① 加大裂解液体积，离心浓缩样品；② 减小洗脱体积（≤30 µL）以提高浓度；③ 必要时联合应用前置富集（如低速离心去宿主、磁珠富集等）。22.10 Q：提取的 RNA 应如何保存？ 短期 -20℃（1 周内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份）。
可以用于哪些下游应用？
可用于 RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA 差异显示、引物延伸分析、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。
常见问题排查
① 柱子堵塞——样品用量太多（参照说明书用量建议）/样品消化不充分（增加 Lysozyme Solution 用量，延长酶消化孵育时间）；② RNA 产量低——试剂准备有误（Buffer RPE 没有加入乙醇稀释或体积不准确，乙醇浓度需控制在 80%）/洗脱不充分（洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数）；③ RNA 降解严重——样品保存有误（非新鲜现取样品应尽量保存 RNA Holder 等保存液中）/提取过程耗材及环境污染。
mRNA 半衰期短，如何保护？
关键策略：RNA 保护剂第一时间加入。流程要点：① 取样后立即加 RNA 保护剂（ES-8735 Simple Protect通用型样本保存液、EK-5302 RNA Holder-RNA组织保护液等）；② 加入后短时涡旋混匀（不要预冷）；③ 4℃ 保存 24 h 或 -80℃ 长期保存。避免：先离心收菌再加裂解液（离心过程 mRNA 已开始降解）；冰浴下储存未保护的菌液（低温下转录虽减慢但 RNase 仍活跃）。
阳性菌细胞壁如何高效破除？
① 收集菌体后弃培养基；② 加 100 µL Lysozyme Solution，上下吹打数次重悬沉淀（说明书提示：若细菌量较大可按细菌量加倍加入溶菌酶的 Buffer TE，后续 Buffer RLT 也要相应增加体积）；③ 涡旋混匀 10 s，37℃ 孵育 10 min（每 2 min 涡旋 10 s 混匀）；④ 加 350 µL Buffer RLT 剧烈振荡。特殊菌：Mycobacterium / Streptococcus 加 mutanolysin、muramidase；产气荚膜梭菌等需要 lysostaphin；难裂解阳性菌可延长 Lysozyme 孵育至 30–60 min。
β-巯基乙醇或 DTT 是必加的吗？
建议添加，熟悉RNA提取人员可不加。操作前在 Buffer RLT 中加入 β-巯基乙醇至终浓度为 1%（建议现配现用），如 1 mL Buffer RLT 中加入 10 µL β-ME（或 20 µL 2M DTT 溶液）。配好的 Buffer RLT 可在 4℃ 维持稳定一个月。
起始量与典型得率？
取适量菌液，室温 5,000×g 离心 10 min 收集革兰氏阴性或阳性细菌（≤5×10⁸ Cells）。若需要处理更多细菌，则相应增加后续各种试剂用量。E. coli 5×10⁸ 细胞典型得率 30–100 µg；阳性菌（Bacillus、Staphylococcus）20–60 µg。
细菌 RNA 提取的核心难点是什么？
细菌 RNA 面临三大挑战：① 细胞壁难破（特别是革兰氏阳性菌的肽聚糖层）；② mRNA 半衰期极短（细菌 mRNA 半衰期 1–10 min）；③ rRNA 占比高（80–90%）。本试剂盒采用「Lysozyme Solution 预处理 + Buffer RLT 异硫氰酸胍裂解 + 硅胶膜柱纯化」工艺，不含酚氯仿等有毒试剂，适用于革兰氏阴性及阳性菌（≤5×10⁸ Cells）。
