EK-1310 FastPure细菌样品RNA提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从革兰氏阴性及阳性菌（≤5×10⁸ Cells）中提取总RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、引物延伸分析、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

Lysozyme Solution置于-20℃保存，其他试剂室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

 14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为14.3 M)或2M DTT溶液

 70%乙醇：RNase-Free水配制

 无水乙醇（96%-100%）

 无酶1.5mL离心管

 无酶吸头

 干净的手套

 高速离心机

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

 操作前在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（β-ME）至终浓度为1%（建议现配现用），如1 mL Buffer RLT中加入10μL β-巯基乙醇（或20μL 2M DTT溶液）。配好的Buffer RLT可在4℃维持稳定一个月。

 Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。

 Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

 Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

 RNase-Free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。

 RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。

 RNA提取操作及离心过程室温进行即可。

操作步骤：

1. 取适量菌液于离心机中室温5,000×g离心10min收集革兰氏阴性或者阳性细菌样品（≤5×10⁸ Cells）。

若需要处理更多细菌，则相应增加后续各种试剂用量。

2. 倒弃培养基，在吸水纸轻轻拍打除尽残液（或用吸头吸尽）

3. 加入100μL Lysozyme Solution，通过上下吹打数次小心地重悬沉淀。

若细菌量较大可按细菌量加倍加入溶菌酶的Buffer TE，后续Buffer RLT也要相应增加体积。

4. 涡旋混匀10s，37°C下孵育10min。在孵育过程中，至少每2min涡旋10s混匀。

5. 加入350μL Buffer RLT（使用前请检查Buffer RLT是否加入β-巯基乙醇或DTT）并剧烈振荡。如果可见颗粒物质，通过离心将其沉淀，取上清液备用。

6. 添加250μL体积的无水乙醇于步骤5的上清溶液中，通过移液混匀，不要离心。

加入乙醇后可能会形成沉淀为正常现象，这不会影响后续的操作步骤。

7. 将步骤6混匀后的溶液转移入RNase-Free吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。

吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。

8. 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1（使用前请确按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

9. 将吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确按要求加入相应体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

10. 重复操作步骤9一次。

11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱子。

12. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL 离心管中，并置于无酶环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。

若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。

13. 向吸附柱膜正中央加入50-100μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置2-3 min。后置于最大转速(~13,400×g)离心3min得到RNA溶液。

RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应立即进行下游实验或置于-80℃储存。

常见问题：

1. 柱子堵塞

 样品用量太多:减少样品用量，参照说明书中提供用量建议。

 样品消化不充分:增加Lysozyme Solution用量，延长酶消化孵育时间。

2. RNA产量低

 试剂准备有误：Buffer RPE没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

 洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。

3. RNA降解严重

 样品保存有误：非新鲜现取样品应尽量保存RNA Holder等保存液中。

 提取过程耗材及环境污染：提取中使用的吸头、离心管等需经无酶处理，环境应尽量选择无酶环境或洁净环境以减少RNase的影响。