产品描述
产品介绍
本试剂盒可以快速地从真菌（酵母）中提取总RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。其提取的总RNA纯度高，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、引物延伸分析、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
Buffer Y1收到后置于-20℃保存；Buffer RLT可室温（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入β-巯基乙醇（或DTT）的Buffer RLT可4℃放置一个月；其他试剂室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为14.3 M)或1M DTT溶液
70%乙醇：RNase-free水配制
无水乙醇（96%-100%）
无RNase酶的1.5mL离心管
无RNase酶的吸头
干净的手套
高速离心机
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
操作前在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（或DTT）至终浓度为1%（建议现配现用，DTT终浓度为约40mM），如1 mL Buffer RLT中加入10μL β-巯基乙醇（或40μL 1M DTT溶液）。配好的Buffer RLT可在4℃维持稳定一个月。
Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。
Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。
操作步骤：
1. 将真菌溶液（≤2×107新鲜真菌（或酵母））在4°C下以1000×g离心5分钟，在12mL或15mL的离心管中收集细胞沉淀。
2. 破壁处理（根据样本类型选择路径A或路径B）：
路径A：酶消化法（推荐用于酵母）
① 加入200μL无菌PBS将沉淀重悬，并转移至新的无酶1.5 mL离心管中。
② 加入10 μL Buffer Y1，在30°C下轻轻摇晃孵育30-40 min。
③ 孵育结束后，直接进入步骤3（裂解）。
路径B：路径 B：物理粉碎法（推荐用于难裂真菌如丝状真菌，得率更高）
① 液氮研磨：将沉淀在液氮中研磨成精细粉末。
② 机械匀浆：或使用高通量研磨仪/破碎机配合无酶珠子进行粉碎。
③ 粉碎完成后，将样本转移至无酶1.5 mL离心管中，直接进入步骤3（裂解）。
3. 加入350μL Buffer RLT并充分涡旋1分钟以裂解真菌。全速 (~13,400×g)离心2分钟，弃沉淀并在后续步骤中仅使用上清液。
若离心后上清液仍显著粘稠（多见于多糖含量高的样本），可补加0.5倍体积（约175μL）的Buffer RLT 稀释混匀。注意：若补加了 RLT，步骤4的无水乙醇用量也要相应增加，保持与裂解液总量1:1的比例。
4. 在上清液中加入1倍体积无水乙醇（约350μL），并通过移液混合均匀。不要离心。立即进入下一步。
5. 将上述步骤溶液转移入RNase-free吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000x g（≥10,000rpm）离心1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。
吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。
6. 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1（使用前请确认Buffer RW1按要求加入0.25倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
7. 将吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
8. 重复步骤7一次。
9. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3分钟干燥柱子。
10. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL 离心管中，并置于无酶环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
11. 向吸附柱膜正中央加入50-100μL RNase-FreeWater，盖上盖子室温静置2-3 min。后置于离心机中最大转速(~13,400×g)离心2min得到RNA溶液。
RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应立即进行下游实验或置于-80℃储存。
常见问题：
1. 柱子堵塞
样品用量太多:减少样品用量，参照说明书中提供用量建议。
样品消化不充分:用液氮或研磨仪充分研磨，延长研磨时间。
2. RNA产量低
试剂准备有误：Buffer RPE没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。
洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。
3. RNA降解严重
样品保存有误：非新鲜现取样品应尽量保存RNA Holder等保存液中。
提取过程耗材及环境污染：提取中使用的吸头、离心管等需经无酶处理，环境应尽量选择无酶环境或洁净环境以减少RNase的影响。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1309、RNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
-20℃保存
常见问题 (FAQ)
提取的 RNA 应如何保存？
短期 -20℃（1 周内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份）。
分生孢子（conidia）RNA 提取为何更困难？
分生孢子壁极厚（多层几丁质 + 疏水性蛋白）且代谢活性低、RNA 含量稀少。优化建议：① 必须机械破壁（路径 B：锆珠 + 球磨仪 30Hz × 3 min，3–5 个循环）；② 必要时在 Buffer RLT 中额外加 SDS（1%）+ β-ME（1%）促进破壁；③ 65℃ 处理时间延长至 1 h；④ 必要时加热-冻融循环（液氮 ↔ 65℃ 各 2 min，3 次）。
典型得率与 RIN 值？
酵母 2×10⁷ 细胞典型得率 30–80 µg 总 RNA；丝状真菌菌丝 50 mg：30–100 µg；分生孢子 1×10⁶：5–20 µg。RIN 值在严格冷链与酶法/物理破壁组合下可达 ≥7。RIN <6 通常因破壁不充分（部分细胞未释放 RNA）或 RNase 灭活不及时所致。
常见问题排查（说明书故障排查表）
① 柱子堵塞——样品用量太多（参照说明书用量建议）/样品消化不充分（用液氮或研磨仪充分研磨，延长研磨时间）；② RNA 产量低——试剂准备有误（Buffer RPE 没有加入乙醇稀释或体积不准确，乙醇浓度需控制在 80%）/洗脱不充分（洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数）；③ RNA 降解严重——样品保存有误（非新鲜现取样品应尽量保存 RNA Holder 等保存液中）/提取过程耗材及环境污染（提取中使用的吸头、离心管等需经无酶处理，环境应尽量选择无酶环境或洁净环境以减少 RNase 的影响）。
Buffer RLT 裂解步骤的关键？
加 350 µL Buffer RLT（已加 β-ME 或 DTT）+ 充分涡旋 1 min 裂解真菌 → 全速（~13,400×g）离心 2 min，弃沉淀仅使用上清。若离心后上清液仍显著粘稠（多见于多糖含量高的样本），可补加 0.5 倍体积（约 175 µL）的 Buffer RLT 稀释混匀。注意：若补加了 RLT，下一步无水乙醇用量也要相应增加，保持与裂解液总量 1:1 的比例。上清加 1 倍体积无水乙醇（约 350 µL）→ 上柱。
路径 A（酶法）与路径 B（物理破壁）如何选？
路径 A（酶消化法，推荐酵母）：① 加 200 µL 无菌 PBS 重悬沉淀，转入新无酶 1.5 mL 离心管；② 加 10 µL Buffer Y1，30℃ 轻轻摇晃孵育 30–40 min；③ 直接进入裂解步骤。路径 B（物理粉碎法，推荐丝状真菌）：① 液氮研磨成精细粉末；② 或使用高通量研磨仪 / 破碎机配合无酶珠子粉碎；③ 转入无酶 1.5 mL 离心管直接进入裂解。
β-巯基乙醇或 DTT 是必加的吗？
建议添加，熟悉RNA提取人员可不加。操作前在 Buffer RLT 中加入 β-巯基乙醇（或 DTT）至终浓度为 1%（建议现配现用，DTT 终浓度约 40 mM），如 1 mL Buffer RLT 中加入 10 µL β-ME（或 40 µL 1M DTT 溶液）。配好的 Buffer RLT 可在 4℃ 维持稳定一个月。
起始量与适用样品？
起始量≤2×10⁷ 新鲜真菌（或酵母），4℃ 1000×g 离心 5 min 收集细胞沉淀。涵盖：① 单细胞酵母（S. cerevisiae、Pichia、Candida）；② 丝状真菌菌丝体（Aspergillus、Fusarium、Penicillium）；③ 真菌孢子；④ 担子菌子实体切片；⑤ 二态性真菌（Histoplasma、Sporothrix）。
真菌 RNA 提取为什么困难？
真菌细胞壁富含几丁质、β-葡聚糖、甘露蛋白，结构远比细菌厚实，常规裂解液无法穿透。本试剂盒采用「Buffer Y1 破壁酶（30℃ 30–40 min）+ Buffer RLT 化学裂解 + 硅胶膜柱纯化」组合工艺，不含酚氯仿等有毒试剂。提供两条破壁路径：路径 A（酶消化法，推荐用于酵母）和路径 B（物理粉碎法，推荐用于难裂真菌如丝状真菌，得率更高）。
