产品描述
产品介绍
本试剂盒可以快速地从不多于1.5mL全血中提取总RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、qPCR、cDNA合成、引物延伸、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为14.3 M)
70%乙醇：使用RNase-Free水配制
无水乙醇（96%-100%）
无酶的1.5mL离心管
无酶吸头
高速离心机
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
操作前在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（β-ME）至终浓度为1%（建议现配现用），如1 mL Buffer RLT中加入10μL β-巯基乙醇（或40μL 1M DTT溶液亦可）。配好的Buffer RLT可在4℃维持稳定一个月。
Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。
Buffer RPE和Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前根据标签指示加入适量乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
RNase-Free Water中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的离心管或玻璃器皿。
Buffer EL 处理阶段建议在4°C离心以抑制RNase活性并稳定细胞状态；上柱后的洗涤步骤可室温进行。
操作步骤：
1. 在适当大小的离心管中将1体积的全血与5体积的Buffer EL混合。
为了获得最佳结果，混合物的体积（血液+Buffer EL）不应超过离心管体积的3/4，以实现有效混合。例如，将5mL Buffer EL加到1mL全血中，并混入总体积为8mL以上的离心管中
注意：使用适量的全血。最多可处理1.5mL健康血液（通常每微升全血有4000-7000个白细胞）。如果使用白细胞数量增加的血液，则适当减少剂量。（在这种情况下，还要在步骤6中调整Buffer RLT的数量。）
2. 在冰上孵育10–15min。在孵育过程期间短暂涡旋2次以充分混匀。
在孵育过程中混浊的悬浮液变为半透明，表明红细胞溶解。如有必要，孵育时间可延长至20min。
3. 在4°C下以400×g离心10min，然后完全去除并丢弃上清液。
离心后白细胞将形成沉淀，确保上清液完全清除。残留痕量红细胞会使沉淀呈红色，这在随后洗涤步骤中将消除。
4. 将Buffer EL加到细胞沉淀中（根据步骤1所用血液体积计算，按每体积全血使用2体积Buffer EL）。通过短暂涡旋重悬细胞。
例如，对于在步骤1中使用1mL全血，则此步骤添加2mL Buffer EL。
5. 在4°C下以400×g离心10min，然后完全去除并丢弃上清液。
注意：上清液的不完全去除会干扰裂解以及随后的RNA与核酸吸附柱的结合，从而导致收率降低。
6. 按下表将Buffer RLT（使用前请检查Buffer RLT是否加入β-巯基乙醇或DTT）添加到沉淀的白细胞中，充分混匀涡旋30s混匀。
注：加入β-巯基乙醇或DTT可彻底断开RNase的二硫键使其永久失活，是防止胰腺、肝脏、血液等样本RNA降解及降低裂解液粘度、防止堵柱的关键，也是减少RNA降解风险的重要补充手段。
当使用非健康血液时，请参考白细胞的数量来确定所需的Buffer RLT的体积。在继续进行均质化步骤之前，应该看不到任何细胞团块。若有细胞团块，则涡旋或移液吹打以清除。若上述操作后依然有明显沉淀块存在，则高速离心沉淀取上清进入第7步实验操作。
Buffer RLT (μL) | Healthy whole blood (mL) | No. of leukocytes |
350 | Up to 0.5 | Up to 2× 106 |
600 | 0.5 to 1.5 | 2× 106 to 1× 107 |
7. 向混合液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350μL或600μL)，并通过移液器吹打混匀（不要涡旋）。将得到的溶液一起转入吸附柱中（吸附柱提前放入收集管中），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
加入乙醇后可能会形成沉淀，这不会影响后续的提取程序。吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。
8. 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1（使用前请确认按瓶身要求加入无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
9. 将吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确认按瓶身要求加入无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。
10. 重复步骤9一次。
11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。
12. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL 离心管管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
13. 向吸附柱膜正中央加入50-100μL RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心2min得到RNA溶液。
RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1304、RNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 RNA 应如何保存？
洗脱：50–100 µL RNase-Free Water 加在膜正中央，盖盖室温静置 3–5 min 后 ≥12,000×g（≥13,000 rpm）离心 2 min；洗脱体积不应少于 30 µL。短期 -20℃（1 周内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份）。临床样品强烈建议「主管 + 备份」双管 -80℃ 保存以备复测。整套试剂室温（15–25℃）干燥保存 12 个月。Buffer EL 用量较大（250 mL/50T）需注意通风；Buffer RLT 出现沉淀时 37℃ 加热溶解后室温使用；Buffer RPE 与 Buffer RW1 第一次使用前按瓶身要求加无水乙醇。
OD260/OD230 偏低（<1.5）怎么办？
血液 RNA 偏低 OD260/OD230 通常源于异硫氰酸胍残留或血红素污染。优化：① 增加 Buffer RPE 洗涤次数（重复一次）；② 必要时上柱前用乙酸钠 + 乙醇沉淀一次；③ 二次柱纯化（用 EK-1103 清理）。
温度控制有哪些关键点？
Buffer EL 处理阶段建议在 4℃ 离心以抑制 RNase 活性并稳定细胞状态；上柱后的洗涤步骤可室温进行。具体：① Buffer EL + 全血混匀后冰上孵育；② 4℃ 400×g 离心 10 min（说明书原文，离心机需预冷）；③ 加 70% 乙醇与 Buffer RLT 后转入吸附柱后即可室温操作。提示：上清液的不完全去除会干扰裂解以及随后的 RNA 与吸附柱的结合，从而导致收率降低。
珠蛋白 mRNA 干扰下游 RNA-seq 怎么办？
珠蛋白 mRNA 占血液总 RNA 70–90%，未去除会浪费 NGS 测序深度。解决方案：① 文库构建后用 GlobinClear / Globin Zero 等试剂去除（对总 RNA 测序更适用）；② 直接用 mRNA 富集（poly-A selection）跳过珠蛋白（仅适合 mRNA 文库）；③ 使用 Tempus 系统 + GlobinClear 组合可使非珠蛋白基因检出率提升 60% 以上。
典型得率与 RIN 值？
1.5 mL EDTA 全血典型得率 5–25 µg 总 RNA；老年患者或淋巴减少症患者得率偏低（2–10 µg）。RIN 值取决于采血到处理的时间：① 采血后 30 min 内处理：RIN 通常 ≥8；② 4℃ 24 h：RIN 6–8；③ 用 PAXgene 类保存管：常温 24 h RIN 仍 ≥7。
β-巯基乙醇或 DTT 是必加的吗？
建议添加，有丰富RNA提取经验操作人员可不加。操作前在 Buffer RLT 中加入 β-巯基乙醇（β-ME）至终浓度为 1%（建议现配现用），如 1 mL Buffer RLT 中加入 10 µL β-巯基乙醇（或 40 µL 1M DTT 溶液亦可）。配好的 Buffer RLT 可在 4℃ 维持稳定一个月。作用：彻底断开 RNase 的二硫键使其永久失活，是防止胰腺、肝脏、血液等样本 RNA 降解及降低裂解液粘度、防止堵柱的关键。
典型操作流程关键参数？
① 5 倍体积 Buffer EL + 1 体积全血混匀（如 5 mL Buffer EL + 1 mL 全血）；② 冰上孵育 10–15 min（必要时延长至 20 min），期间短暂涡旋 2 次；③ 4℃ 400×g 离心 10 min，弃上清；④ 加 Buffer EL（每体积全血用 2 体积，如步骤 1 用 1 mL 全血则此步加 2 mL）重悬白细胞，再次 4℃ 400×g 离心 10 min；⑤ 按白细胞量加 Buffer RLT：350 µL（≤2×10⁶ 白细胞 / ≤0.5 mL 全血）或 600 µL（2×10⁶–1×10⁷ / 0.5–1.5 mL 全血）。
适用哪些血液样品？
适用：① 新鲜抗凝全血（EDTA / 柠檬酸钠抗凝，0.5–1.5 mL）；② 专用 RNA 保存管（PAXgene / Tempus 类）采集的血液样品；③ 白细胞分离后的白细胞悬液。不推荐：肝素抗凝全血（肝素抑制下游 PCR）；冷冻全血（红细胞溶解后 RNase 释放，RNA 已部分降解）；富血红蛋白严重溶血样品。
从血液提取 RNA 的核心难点是什么？
全血 RNA 提取面对两大挑战：① 血红蛋白珠蛋白 mRNA（globin mRNA）占血液总 RNA 的 70–90%，会大量稀释目标基因表达信号；② 红细胞富含 RNase，操作不及时容易降解。本试剂盒采用「Buffer EL 红细胞裂解 + 白细胞富集 + Buffer RLT 裂解 + 硅胶膜柱纯化」流程获得相对富集的白细胞 mRNA；如需更彻底去除珠蛋白，可在文库构建前加 GlobinClear 处理。说明书规范处理量：1.5 mL 健康全血（每微升约 4000–7000 个白细胞）；不含酚氯仿等有毒试剂。
