产品描述
产品介绍
本试剂盒可以快速地从动物细胞中提取总RNA。其提取的总RNA 纯度高（存在基因组DNA），无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、qPCR、cDNA合成、引物延伸、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
70%乙醇：RNase-free水配制
无水乙醇（96%-100%）
无RNase酶的1.5mL离心管
无RNase酶的枪头
干净的手套
高速离心机
物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。
Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。
若处理 RNase 含量丰富的组织如肝脏/胰腺/肾脏/脾脏，建议在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（或DTT溶液亦可），如1 mL Buffer RLT中加入10μL β-巯基乙醇（或40μL 1M DTT溶液亦可）。
操作步骤：
1. 样本准备与裂解：请根据样品种类选择以下处理方式
1a. 动物细胞（离心收集法）：适用于悬浮细胞或经胰酶处理脱落的贴壁细胞。
① 将细胞（不超过1×107个）转入离心管，300×g离心5 min，彻底弃除上清。
② 加入PBS重悬细胞清洗一次，再次离心弃净上清。
③ 向细胞沉淀中加入600μL Buffer RLT（细胞数< 5×106时可用350μL），涡旋或吹打至无肉眼可见细胞团块，进行步骤2。
注： 若裂解后有明显沉淀，请最大转速离心 2 min，取上清进行步骤 2。
1b. 动物细胞（皿内直接裂解法）：适用于贴壁牢固的细胞，可有效减少RNA降解。
① 吸尽培养基，用PBS清洗1-2次并彻底吸干残留液体。
② 直接向皿中加入600μL Buffer RLT，涡旋或吹打至无肉眼可见细胞团块。
③ 将裂解液全部转移至新的无酶1.5 mL离心管中，进行步骤2。
注：若裂解后有明显沉淀则最大转速离心2min，取上清。
1c. 动物组织：
① 取10-30 mg 组织（切勿超过 30 mg）移入离心管，加入600μL Buffer RLT。
② 使用电动研磨机或研磨杵彻底匀浆（组织必须完全粉碎）。
③ 最大转速（~13,400×g）离心 3 min，小心吸取澄清的上清液转移至新管进行步骤2。
注：吸取上清时切勿触碰管底沉淀，以免堵塞吸附柱或污染基因组 DNA。
2. 向上述所得裂解液（细胞裂解液或组织离心上清）中加入1倍体积的 70%乙醇（使用RNase-free water配制），立即用移液器吹打混匀。
注意：混匀后可能会出现丝状沉淀，请勿离心。务必将混匀液（含沉淀）全部转移至吸附柱中。
3. 将步骤2混匀后的溶液转移入RNase-free吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。
吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。
4. 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1（使用前请确认Buffer RW1是否按要求加入0.25倍体积无水乙醇）, ≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。
5. 向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE是否按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。
6. 重复步骤5一次。
7. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。
8. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL离心管管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。
9. 向吸附柱膜正中央加入30-100μL RNase-free Water，盖上盖子室温静置1-3 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心2min得到RNA溶液。
RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。
RNA纯度及浓度检测
纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10 mM Tris pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free ddH2O稀释n 倍，用RNase-free ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40
产品规格
- 货期
- 现货
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1303、RNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 RNA 应如何保存？
短期 -20℃（1 周内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份），避免反复冻融。
本试剂盒与RNAex ZOL法（EK-1300）的选择？
EK-1303（柱法）：适合常规中低纤维组织、培养细胞，操作快、安全、无苯酚；EK-1300（RNAEx ZOL + 柱）：富 RNase 或高纤维 / 富脂样品（脾、胰、脂肪）首选，因 RNAEx ZOL 瞬间灭活 RNase 效果更彻底。如不确定，建议两者各试 1–2 个样品后选择。
RNA 完整性差（28S/18S 比值低或弥散）怎么办？
RNA 降解原因：① 样品取材后未及时冻存或加入 RNA 保护剂（如 ES-8735 Simple Protect）；② 反复冻融原始样品；③ 操作中 RNase 污染；④ 富 RNase 样品（肝、胰腺、肾、脾）未加 β-巯基乙醇或 DTT。建议：① 组织取样后 5 min 内液氮速冻 -80℃；② 实验室操作时用 EX-0411 核酸酶清除剂处理桌面与设备；③ 检查移液器吸头与管子的 RNase-free 等级；④ 富 RNase 样品改用 RNAex ZOL 工艺（EK-1300）或在 Buffer RLT 中加 β-ME / DTT。
可以用于 NGS RNA-seq 吗？
可以。NGS 文库构建对 RNA 质量要求：① RIN ≥7（凝胶电泳或 TapeStation 测定）；② OD260/OD280 ≥1.9 且 OD260/OD230 ≥1.8；③ 总量 100 ng–1 µg（依文库类型）；④ 严格无 gDNA 污染（必须 DNase 处理）。本试剂盒提取的 RNA 在标准操作 + DNase 处理后完全满足要求。
OD260/OD280 比值偏低（<1.8）说明什么？
OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数在 1.8–2.1 之间，比值为 2.0 是高质量 RNA 的标志。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假定在 10 mM Tris pH 7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.8–2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5–1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。RNA 浓度公式：终浓度（ng/µL）= OD260 × 稀释倍数 × 40。低于 1.8 可能因匀浆不彻底、柱洗涤次数不足或 RNA 浓度过低（<5 ng/µL）测量误差大。
组织样品如何匀浆？
取 10–30 mg 组织 + 600 µL Buffer RLT，使用电动研磨机或研磨杵彻底匀浆（组织必须完全粉碎）；最大转速（~13,400×g）离心 3 min，小心吸取澄清的上清液转移至新管。匀浆方法选择：① 液氮预冷研磨成细粉后转入 Buffer RLT；② 玻璃 Teflon 匀浆器手动匀浆 10–20 次；③ 电动 TissueLyser / Bullet Blender + 钢珠或锆珠 30 Hz × 30 s。
典型得率？
肝、脾等高表达组织 30 mg：50–150 µg；肌肉、脑等中等表达 30 mg：15–60 µg；培养细胞 1×10⁶ HEK293 通常 5–15 µg；HeLa 类癌细胞略高（10–20 µg）。得率主要受样品新鲜度、裂解效率、柱过载与否影响。
适用样品类型与起始量？
① 动物细胞离心收集法（≤1×10⁷ 细胞）；② 皿内直接裂解法（适用于贴壁牢固的细胞，可有效减少 RNA 降解）；③ 动物组织（10–30 mg，切勿超过 30 mg）。Buffer RLT 用量：细胞 600 µL；细胞数 <5×10⁶ 时可减为 350 µL；组织 600 µL。关键提示：富 RNase 组织（肝、胰腺、肾、脾）建议在 Buffer RLT 中加 β-巯基乙醇（1 mL Buffer RLT 加 10 µL β-ME）或 DTT（40 µL 1M DTT），可彻底断开 RNase 二硫键使其永久失活。
本试剂盒采用什么工艺？
本试剂盒采用纯硅胶膜柱法（不含苯酚）：① Buffer RLT（异硫氰酸胍）瞬时灭活 RNase 并裂解细胞；② 加入 1 倍体积 70% 乙醇调整结合条件；③ RNA 选择性结合 RNase-free 吸附柱；④ Buffer RW1（含 0.25 倍乙醇）+ Buffer RPE（含 4 倍乙醇）洗涤；⑤ RNase-free Water 洗脱。全流程 25–35 min。可用于 RT-PCR、qPCR、cDNA 合成、Northern Blot 等下游实验。
