EK-1303 FastPure动物细胞/组织总RNA提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从动物细胞中提取总RNA。其提取的总RNA 纯度高（存在基因组DNA），无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、qPCR、cDNA合成、引物延伸、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

 70%乙醇：RNase-free水配制

 无水乙醇（96%-100%）

 无RNase酶的1.5mL离心管

 无RNase酶的枪头

 干净的手套

 高速离心机

 物理研磨设备

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

 Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。

 Buffer RW1作为浓缩液提供，在第一次使用前加入0.25倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

 Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

 RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。

 RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。

 若处理 RNase 含量丰富的组织如肝脏/胰腺/肾脏/脾脏，建议在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（或DTT溶液亦可），如1 mL Buffer RLT中加入10μL β-巯基乙醇（或40μL 1M DTT溶液亦可）。

操作步骤：

1. 样本准备与裂解：请根据样品种类选择以下处理方式

1a. 动物细胞（离心收集法）：适用于悬浮细胞或经胰酶处理脱落的贴壁细胞。

①　将细胞（不超过1×10⁷个）转入离心管，300×g离心5 min，彻底弃除上清。

②　加入PBS重悬细胞清洗一次，再次离心弃净上清。

③　向细胞沉淀中加入600μL Buffer RLT（细胞数< 5×10⁶时可用350μL），涡旋或吹打至无肉眼可见细胞团块，进行步骤2。
注： 若裂解后有明显沉淀，请最大转速离心 2 min，取上清进行步骤 2。

1b. 动物细胞（皿内直接裂解法）：适用于贴壁牢固的细胞，可有效减少RNA降解。

①　吸尽培养基，用PBS清洗1-2次并彻底吸干残留液体。

②　直接向皿中加入600μL Buffer RLT，涡旋或吹打至无肉眼可见细胞团块。

③　将裂解液全部转移至新的无酶1.5 mL离心管中，进行步骤2。
注：若裂解后有明显沉淀则最大转速离心2min，取上清。

1c. 动物组织：

①　取10-30 mg 组织（切勿超过 30 mg）移入离心管，加入600μL Buffer RLT。

②　使用电动研磨机或研磨杵彻底匀浆（组织必须完全粉碎）。

③　最大转速（~13,400×g）离心 3 min，小心吸取澄清的上清液转移至新管进行步骤2。
注：吸取上清时切勿触碰管底沉淀，以免堵塞吸附柱或污染基因组 DNA。

2. 向上述所得裂解液（细胞裂解液或组织离心上清）中加入1倍体积的 70%乙醇（使用RNase-free water配制），立即用移液器吹打混匀。

注意：混匀后可能会出现丝状沉淀，请勿离心。务必将混匀液（含沉淀）全部转移至吸附柱中。

3. 将步骤2混匀后的溶液转移入RNase-free吸附柱中并套上2mL收集管，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。

吸附柱最大上柱量为700μL，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2mL收集管中。

4. 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1（使用前请确认Buffer RW1是否按要求加入0.25倍体积无水乙醇）, ≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。

5. 向吸附柱中加入500μL Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE是否按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。

6. 重复步骤5一次。

7. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。

8. 将吸附柱套入新的无酶1.5mL离心管管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。

若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。

9. 向吸附柱膜正中央加入30-100μL RNase-free Water，盖上盖子室温静置1-3 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心2min得到RNA溶液。

RNA洗脱体积不应少于30μL，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。

RNA纯度及浓度检测

纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10 mM Tris pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free ddH2O稀释n 倍，用RNase-free ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：

终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40