EK-1217 FastPure FFPE石蜡切片基因组DNA提取试剂盒

产品介绍

本产品FFPE提取试剂盒专为从甲醛固定、石蜡包埋的组织切片中提取DNA而设计。该试剂盒采用特殊的裂解条件释放组织切片中的DNA，并克服了由于甲醛交联核酸而引起的抑制效应。纯化的DNA可用于各种下游应用，如PCR、单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复（STR）基因分型以及药物基因组研究等。

存储条件

Proteinase K Solution可在2~8℃保存，其余试剂可以室温(15~25℃)下保存12个月。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：

□ Buffer ATL, Buffer AL或Buffer AW1若有沉淀析出，可在55℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

□ Proteinase K Solution保存于2-8℃，反复冻融会影响其活性。

□ 小型高速离心机（~13000rpm）

□ 水浴锅/加热块温度分别设置至56℃和90℃

开始前试剂准备

□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer AW1，于室温密封保存。

□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer AW2，于室温密封保存。

注意事项

1. 拿到样品后要尽快在4-10%的福尔马林中固定，固定时间以8-24小时为宜。时间过长导致基因组断裂，影响下游实验。确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制PCR检测酶的作用。

2. 本产品所提取的DNA的完整性依赖于样本类型、储存时间以及固定条件。如果甲醛固定时间过长或样本存放时间过久（超过1年），则易导致DNA完整性受损，无法扩出长片段。由于 FFPE 样本的特殊性，建议下游PCR扩增产物长度控制在200 bp以内，以获得最佳成功率。

3. 环境温度较低时建议观察Buffer ATL是否澄清，若有沉淀，必须55°C加热至完全透明方可使用，否则裂解效率会大打折扣。

4. 本试剂盒中离心步骤全程室温离心，低温会使石蜡析出，这是FFPE提取失败最常见的原因。

操作步骤：

1. 样本处理

a. 石蜡切片：取5-8张石蜡切片，每张厚度为5-10μm，尺寸为1×1cm。

b. 石蜡块：使用手术刀刮取约30mg的组织样本（尽量去除多余的石蜡）。注意：如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2~3片弃掉不用。

c. 福尔马林等固定液中的样本：取30mg样本，用手术刀切成数块，置于1.5mL离心管中，加入500μL 1×PBS，涡旋振荡混匀，以12,000×g室温离心1min。弃去上清，重复此步骤3次。

2. 将石蜡切片或石蜡块切片放入1.5或2mL微量离心管中，并向样品中加入1mL二甲苯。关闭盖子，剧烈振荡10s。

3. 在室温（15-25°C）下以12,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。

4. 向沉淀中加入1mL无水乙醇，并通过涡旋混合约10s。

5. 在室温（15-25°C）下以12,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。

注意：尽可能用细管吸弃更多上清乙醇液。若沉淀中仍有明显的石蜡块，建议重复一次二甲苯脱蜡步骤。加入乙醇后务必彻底涡旋，以确保二甲苯被完全洗去。

6. 打开离心管盖，并在室温放置10min或直到所有残留的乙醇挥发。

7. 加入180μL Buffer ATL和20μL蛋白酶K溶液，并通过涡旋混合。在56°C下孵育1h（或直到样品完全裂解）。

8. 转移到90°C下再孵育1h

注意：在Buffer ATL中的90°C孵育部分地逆转了核酸的甲醛修饰。严禁超过90°C或延长孵育时间，否则会导致 DNA 进一步降解，影响下游长片段PCR扩增。此步骤用于释放被甲醛锁住的 DNA碱基，是保证PCR扩增成功的前提。

9. （可选步骤）加入2μL RNase A Solution（100mg/mL）至消化液中，颠倒混匀，室温孵育2min。注：在加入RNase A前，让样品冷却至室温。

10. 在上管样品中加入200μL Buffer AL，必须先剧烈涡旋混匀；然后加入200μL无水乙醇，再次通过涡旋彻底混合。

注意：加入Buffer AL和乙醇时可能会形成白色沉淀物为正常现象，不会影响后续提取。

11. 把吸附柱套在2mL收集管中。将上一步骤所得溶液加入柱中，8000×g离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：若柱子出现堵塞，可提高转速至14000×g离心3-5min。若溶液体积超过700μL则分次上柱。

12. 向吸附柱中加入500μL Buffer Buffer AW1（请先检查是否已加入无水乙醇），8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

13. 向吸附柱中加入500μL Buffer AW2（请先检查是否已加入无水乙醇），8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

14. 重复步骤13一次。

15. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜。将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管，开盖室温静置 5-10 min。

注意：Buffer AW2中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验，直至观察吸附柱膜表面无明显液体反光，且闻不到酒精味。若环境湿度大，可适当延长晾干时间。

16. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加50-100μL Buffer ATE，室温静置1min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液并置于-20℃保存。

注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。为了提高DNA的回收量，可将Buffer ATE加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。对于组织量较少的切片（<3张），建议洗脱体积缩小至 30-50μL，以获得更高浓度的 DNA 用于下游扩增。