产品描述
产品介绍
本产品FFPE提取试剂盒专为从甲醛固定、石蜡包埋的组织切片中提取DNA而设计。该试剂盒采用特殊的裂解条件释放组织切片中的DNA，并克服了由于甲醛交联核酸而引起的抑制效应。纯化的DNA可用于各种下游应用，如PCR、单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复（STR）基因分型以及药物基因组研究等。
存储条件
Proteinase K Solution可在2~8℃保存，其余试剂可以室温(15~25℃)下保存12个月。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL离心管
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：
□ Buffer ATL, Buffer AL或Buffer AW1若有沉淀析出，可在55℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
□ Proteinase K Solution保存于2-8℃，反复冻融会影响其活性。
□ 小型高速离心机（~13000rpm）
□ 水浴锅/加热块温度分别设置至56℃和90℃
开始前试剂准备
□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer AW1，于室温密封保存。
□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer AW2，于室温密封保存。
注意事项
1. 拿到样品后要尽快在4-10%的福尔马林中固定，固定时间以8-24小时为宜。时间过长导致基因组断裂，影响下游实验。确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制PCR检测酶的作用。
2. 本产品所提取的DNA的完整性依赖于样本类型、储存时间以及固定条件。如果甲醛固定时间过长或样本存放时间过久（超过1年），则易导致DNA完整性受损，无法扩出长片段。由于 FFPE 样本的特殊性，建议下游PCR扩增产物长度控制在200 bp以内，以获得最佳成功率。
3. 环境温度较低时建议观察Buffer ATL是否澄清，若有沉淀，必须55°C加热至完全透明方可使用，否则裂解效率会大打折扣。
4. 本试剂盒中离心步骤全程室温离心，低温会使石蜡析出，这是FFPE提取失败最常见的原因。
操作步骤：
1. 样本处理
a. 石蜡切片：取5-8张石蜡切片，每张厚度为5-10μm，尺寸为1×1cm。
b. 石蜡块：使用手术刀刮取约30mg的组织样本（尽量去除多余的石蜡）。注意：如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2~3片弃掉不用。
c. 福尔马林等固定液中的样本：取30mg样本，用手术刀切成数块，置于1.5mL离心管中，加入500μL 1×PBS，涡旋振荡混匀，以12,000×g室温离心1min。弃去上清，重复此步骤3次。
2. 将石蜡切片或石蜡块切片放入1.5或2mL微量离心管中，并向样品中加入1mL二甲苯。关闭盖子，剧烈振荡10s。
3. 在室温（15-25°C）下以12,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。
4. 向沉淀中加入1mL无水乙醇，并通过涡旋混合约10s。
5. 在室温（15-25°C）下以12,000×g离心2 min，弃上清。注意：不要倒掉沉淀。
注意：尽可能用细管吸弃更多上清乙醇液。若沉淀中仍有明显的石蜡块，建议重复一次二甲苯脱蜡步骤。加入乙醇后务必彻底涡旋，以确保二甲苯被完全洗去。
6. 打开离心管盖，并在室温放置10min或直到所有残留的乙醇挥发。
7. 加入180μL Buffer ATL和20μL蛋白酶K溶液，并通过涡旋混合。在56°C下孵育1h（或直到样品完全裂解）。
8. 转移到90°C下再孵育1h
注意：在Buffer ATL中的90°C孵育部分地逆转了核酸的甲醛修饰。严禁超过90°C或延长孵育时间，否则会导致 DNA 进一步降解，影响下游长片段PCR扩增。此步骤用于释放被甲醛锁住的 DNA碱基，是保证PCR扩增成功的前提。
9. （可选步骤）加入2μL RNase A Solution（100mg/mL）至消化液中，颠倒混匀，室温孵育2min。注：在加入RNase A前，让样品冷却至室温。
10. 在上管样品中加入200μL Buffer AL，必须先剧烈涡旋混匀；然后加入200μL无水乙醇，再次通过涡旋彻底混合。
注意：加入Buffer AL和乙醇时可能会形成白色沉淀物为正常现象，不会影响后续提取。
11. 把吸附柱套在2mL收集管中。将上一步骤所得溶液加入柱中，8000×g离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：若柱子出现堵塞，可提高转速至14000×g离心3-5min。若溶液体积超过700μL则分次上柱。
12. 向吸附柱中加入500μL Buffer Buffer AW1（请先检查是否已加入无水乙醇），8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
13. 向吸附柱中加入500μL Buffer AW2（请先检查是否已加入无水乙醇），8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
14. 重复步骤13一次。
15. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜。将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管，开盖室温静置 5-10 min。
注意：Buffer AW2中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验，直至观察吸附柱膜表面无明显液体反光，且闻不到酒精味。若环境湿度大，可适当延长晾干时间。
16. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加50-100μL Buffer ATE，室温静置1min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液并置于-20℃保存。
注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。为了提高DNA的回收量，可将Buffer ATE加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。对于组织量较少的切片（<3张），建议洗脱体积缩小至 30-50μL，以获得更高浓度的 DNA 用于下游扩增。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1217、基因组DNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温(15~25℃)下保存
常见问题 (FAQ)
提取的 DNA 应如何保存？
短期 4℃（≤1 周）；长期 -20℃ 或 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份）。FFPE DNA 因本身高度降解，反复冻融后片段长度还会进一步下降，建议按下游应用预分装。
从 LCM 激光显微切割样品如何提取？
微量样品（<100 cells，<10 ng 起始量）建议：① 减小裂解液体积至 50 μL；② Proteinase K 用量减半但消化时间延长（56℃ 4–16 h 或过夜）；③ 加 carrier RNA / 糖原作为载体；④ 减小洗脱体积至 30–50 μL（说明书原文：对于组织量较少的切片（<3 张），建议洗脱体积缩小至 30–50 μL，以获得更高浓度的 DNA 用于下游扩增）；⑤ 必要时用 WGA（如 Repli-G FFPE）扩增模板。
可以用于哪些下游应用？
PCR、单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复（STR）基因分型以及药物基因组研究、短扩增子 PCR（基因突变热点、特定外显子）、NGS 文库（短读长 panel 测序、外显子组、肿瘤突变检测）、定量 PCR（基因拷贝数检测）、甲基化分析（亚硫酸盐转化）、FISH 探针制备。不适合：长读长测序（PacBio HiFi / ONT）、需要 ≥10 kb 完整片段的应用。
哪些样品类型不适合本试剂盒或需要特殊优化？
① 拿到样品后要尽快在 4–10% 的福尔马林中固定，固定时间以 8–24 小时为宜——时间过长导致基因组断裂；② 确保包埋前样品彻底脱水，残留福尔马林会抑制 PCR 检测酶；③ FFPE 样本的 DNA 完整性依赖于样本类型、储存时间以及固定条件，储存超过 1 年易导致 DNA 完整性受损；④ 本试剂盒中离心步骤全程室温，低温会使石蜡析出，这是 FFPE 提取失败最常见的原因；⑤ 环境温度低时观察 Buffer ATL 是否澄清，有沉淀必须 55℃ 加热至完全透明方可使用。冷冻组织请改用 EK-1204。
OD260/OD280 比值正常但 PCR 不工作怎么办？
FFPE DNA 的 OD260/OD280 在 1.7–2.0 不能完全反映可用性——即使纯度好，DNA 仍可能高度断裂或带有甲醛加合物。建议：① 用 Qubit dsDNA HS 测有效双链 DNA 浓度（NanoDrop 会高估）；② 模板用量加倍（FFPE 推荐 100–200 ng / qPCR）；③ 选择短扩增子（<200 bp，与说明书建议一致）；④ 若 PCR 仍失败，使用 PreCR 类酶预处理（NEB）修复部分损伤；⑤ 福尔马林固定时间过长（>24 h）或样本存放 >1 年都会显著加重交联损伤。
为什么 90℃ 去交联（de-crosslinking）步骤至关重要？
甲醛与碱基（特别是 dCMP）形成羟甲基化加合物，PCR 聚合酶遇到此类损伤会停滞或引入错误。56℃ Buffer ATL 中孵育 1 h（或直到样品完全裂解）→ 转移到 90℃ 下再孵育 1 h。严禁超过 90℃ 或延长孵育时间，否则会导致 DNA 进一步降解，影响下游长片段 PCR 扩增。此步骤用于释放被甲醛锁住的 DNA 碱基，是保证 PCR 扩增成功的前提。该步骤可使 PCR / NGS 成功率从 50% 提升至 ≥90%。
DNA 片段长度（fragment size）一般多大？
FFPE DNA 因甲醛交联与水解，片段长度通常较短：短期储存（<3 年）样品平均 1–5 kb；长期储存或酸性甲醛固定样品平均 200 bp – 1 kb；偶有 <200 bp 的极度降解样品。由于 FFPE 样本的特殊性，建议下游 PCR 扩增产物长度控制在 200 bp 以内，以获得最佳成功率。这决定了下游应用：短读长 NGS（Illumina）、qPCR 与扩增子测序均可用；不适合长读长测序。
脱蜡步骤有哪些注意事项？
① 加 1 mL 二甲苯，剧烈振荡 10 s；② 室温 12,000×g 离心 2 min，弃上清但不要倒掉沉淀；③ 加 1 mL 无水乙醇涡旋 10 s；④ 室温 12,000×g 离心 2 min 弃上清；⑤ 打开管盖室温放置 10 min 或直至所有残留乙醇挥发。尽可能用细管吸弃更多上清乙醇液。若沉淀中仍有明显的石蜡块，建议重复一次二甲苯脱蜡步骤。加入乙醇后务必彻底涡旋，以确保二甲苯被完全洗去。二甲苯有毒，请在通风柜内操作。
典型起始量与得率是多少？
① 石蜡切片：5–8 张，每张厚度 5–10 μm，尺寸 1×1 cm；② 石蜡块：手术刀刮取约 30 mg 组织样本（尽量去除多余的石蜡，最初刮取的 2–3 片弃掉不用）；③ 福尔马林等固定液样本：取 30 mg。典型得率：新鲜 FFPE 块（<1 年）通常 1–10 μg DNA；储存 1–5 年的样品 0.5–5 μg；储存 >10 年或固定不当样品 0.1–2 μg。得率受石蜡块年限、固定方式（中性缓冲甲醛 vs. 酸性甲醛）影响显著。
为什么 FFPE 样品需要专用试剂盒？
甲醛固定后蛋白与 DNA 之间会形成共价交联，且石蜡覆盖使常规裂解液无法接触组织。本试剂盒专为 FFPE 切片设计，采用「二甲苯脱蜡 + 56℃ Buffer ATL 裂解 + 90℃ 高温去交联 + 硅胶柱纯化」工艺：先 1 mL 二甲苯剧烈振荡溶解石蜡，无水乙醇洗去二甲苯；再 56℃ 蛋白酶 K 消化 1 h，关键的 90℃ 孵育 1 h 部分逆转甲醛核酸交联；最后用 Buffer AW1/AW2 漂洗、Buffer ATE 洗脱。
