产品描述
产品介绍
本试剂盒可快捷简单的从新鲜或冷冻的粪便样本中纯化总DNA。本试剂盒纯化的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒回收的DNA可直接用于PCR等其它分子生物学下游实验。
存储条件
本产品除Proteinase K和RNase A溶液外，可在室温(15~25℃)保存12个月。Proteinase K和RNase A溶液收到后请分装保存于-20℃。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL/2mL离心管
□ 离心机
□ 涡旋仪
□ 水浴锅（将温度调至70℃）
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
□ Inhibit EX Buffer 如有沉淀现象，可37-70℃水浴至完全溶解。
□ Inhibit EX Buffer在存储过程中可能会出现颜色变化（橙色）；这不会影响缓冲区的功能。
□ Buffer AL如有沉淀现象，可70℃水浴至完全溶解。
□ 所有离心均在室温（15-25℃）下完成。
开始前试剂准备
□ Buffer AW1按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
□ Buffer AW2按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
DNA浓度及纯度检测
回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯度与浓度。
DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会略低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
操作步骤：
1. 取180-220mg的粪便放入2mL离心管中，并将该管放置在冰上等待使用。后续所有操作应在室温下进行。
当样品少于180mg也可正常进行。在使用少量的粪便时，不需要减少缓冲液的量。如果样品为液体，则将样品量改为200µL（用剪去尖部的枪头能更好的吸取）；如果样品为冷冻的粪便，则用手术刀切取180-220mg，注意在使用冷冻粪便时应避免样品在步骤2加入Inhibit EX Buffer前解冻，这会使DNA降解。
2. 在每个粪便样品中添加1mL Inhibit EX Buffer，涡旋1min或直到样品完全混匀。
彻底涡旋样品很重要，这有助于确保最终洗脱液中的获得最多DNA。
3. 在70℃下水浴加热5min，期间可适当涡旋2-3次，每次涡旋约15s。
提取革兰氏阳性菌或某些寄生虫DNA时，可将温度调至95℃加热10min。若仅提取动物宿主细胞DNA，可跳过此步骤。
4. 最大转速 (~13,400×g)离心3min以沉淀颗粒物，吸取200µL上清液转移至新的2mL离心管中。
转移上清液时应避免吸到任何固体颗粒，如果上清中仍有可见颗粒，应再次离心样品。
5. 在装有200µL上清液的离心管中加入15µL Proteinase K溶液。再加入200µL Buffer AL并涡旋15s使溶液混匀。
注意：Proteinase K溶液不能与Buffer AL先混合，需先后混匀加入。Buffer AL与样品需完全混匀。若需要更高产量，可吸取更多上清液，但后续的Proteinase K、Buffer AL和乙醇需按比例相应增加
6. 70℃下水浴加热10min。
7. （可选步骤）若需去除RNA，加入10µL RNase A Solution（20mg/mL)至溶液中，混匀后室温静置10min。
8. 向离心管中加入200µL的无水乙醇，涡旋混匀。
9. 将上述混匀的溶液转移至吸附柱上，盖上盖子，最大转速 (~13,400×g)离心1min。
如果溶液未完全通过吸附柱，则再次离心直至全部溶液通过吸附柱。
10. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µL Buffer AW1（请先检查是否已加入无水乙醇）至柱子上并以12,000×g离心1min。
11. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µL Buffer AW2（请先检查是否已加入无水乙醇）至柱子中，12,000×g离心1min。
12. 重复操作步骤11一次。
13. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。最大转速 (~13,400×g)离心空柱2min，以甩干柱子的残留物质。(这一步要尽量提高离心速度以减少乙醇的残留)。
注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
14. 将柱子转移至新的1.5mL无菌的离心管，敞开盖子室温静置10min以彻底晾干漂洗液。
注意：粪便样本对 PCR 抑制极其敏感，任何乙醇残留都会与残留的抑制剂产生叠加效应，导致扩增失败。
15. 加入30~100µL预热至70ºC的Buffer ATE至柱子的膜中央，静置2min后以最大转速 (~13,400×g)离心2min收集离心下的基因组DNA。
16. 弃去柱子，将基因组DNA溶液于-20℃保存（短期可保存2-8℃）或进行下游实验。
常见问题：
1. DNA产量低
样品储存错误：粪便样品建议储存在-20°C或-80°C
粪便样本在Inhibit EX Buffer中未充分匀浆：用新样品重复DNA纯化过程。 确保将样品和Inhibit EX缓冲液混合，直到样品完全均质
Buffer AL混匀不充分：用新样品重复DNA纯化程序。确保通过涡旋立即彻底混合样品和Buffer AL
试剂准备有误：Buffer AW1和Buffer AW2 没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)
2. DNA在下游反应表现不佳
下游反应中使用的DNA过多：PCR可能会被过量的DNA模板抑制，减少下游反应中使用的DNA量。
靶细胞裂解效率低下：如果靶细胞难以裂解，如某些细菌和寄生虫，则洗脱液中靶DNA的量可能较低。在未来的准备工作中，根据需要将裂解温度提高至95°C和/或孵育时间。
3. 提取出的 DNA 颜色发黄/发褐
样本中血红素降解产物或多糖多酚含量极高。减少起始粪便量至100-150mg同时增加一次Buffer AW1的洗涤。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1212、基因组DNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温(15~25℃)保存
常见问题 (FAQ)
提取的 DNA 应如何储存？
洗脱：短期可保存 2–8℃）；长期：-20℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份）。微生物组学研究建议：① 母液 -80℃ 保存 ≥5 年；② 测序前重新 Qubit 测浓度；③ 避免反复冻融 >3 次。
DNA 产量低如何排查？
① 样品储存错误：粪便样品建议储存在 -20°C 或 -80°C；② 粪便样本在 Inhibit EX Buffer 中未充分匀浆：用新样品重复 DNA 纯化过程，确保将样品和 Inhibit EX 缓冲液混合直到完全均质（涡旋 1 min 或直到样品完全混匀）；③ Buffer AL 混匀不充分：用新样品重复 DNA 纯化程序，确保通过涡旋立即彻底混合样品和 Buffer AL；④ 试剂准备有误：Buffer AW1 和 Buffer AW2 没有加入乙醇稀释或体积不准确（乙醇浓度需控制在 80%）。
DNA 在下游反应表现不佳如何排查？
① 下游反应中使用的 DNA 过多：PCR 可能会被过量的 DNA 模板抑制，减少下游反应中使用的 DNA 量；② 靶细胞裂解效率低下：如果靶细胞难以裂解，如某些细菌和寄生虫，则洗脱液中靶 DNA 的量可能较低。根据需要将裂解温度提高至 95℃和/或孵育时间。建议：在生物安全二级实验室操作；使用一次性耗材；阳性对照与阴性对照同步处理。注意：本试剂盒未经临床体外诊断认证，仅供科研使用。
提取的 DNA 适合哪些下游应用？
PCR 、16S rRNA / ITS 扩增子测序（人/动物肠道菌群分析）、宏基因组 shotgun 测序、病原体检测 qPCR（沙门氏菌、大肠杆菌 O157、艰难梭菌等）、寄生虫 DNA 检测（贾第虫、隐孢子虫）、食物来源 DNA 分析、法医学应用（粪便人源 DNA 鉴定）。
为什么 70℃ 水浴步骤如此关键？
Inhibit EX Buffer 重悬粪便后 70℃ 水浴 5 min（期间涡旋 2–3 次，每次 15 s）；加 Proteinase K + Buffer AL 后 70℃ 水浴 10 min。70℃ 高温作用：① 释放与基质结合的 DNA；② 失活内源 DNase；③ 协助 Inhibit EX Buffer 沉淀抑制剂。特殊样品：提取革兰氏阳性菌或某些寄生虫 DNA 时，可将温度调至 95℃ 加热 10 min；若仅提取动物宿主细胞 DNA，可跳过加热步骤。
洗脱液发黄或下游 PCR 抑制怎么办？
颜色异常或 PCR 抑制提示胆汁酸或多酚残留。说明书故障排查：提取出的 DNA 颜色发黄/发褐——样本中血红素降解产物或多糖多酚含量极高。减少起始粪便量至 100–150 mg 同时增加一次 Buffer AW1 的洗涤。额外策略：① 上 PCR 前模板 10 倍稀释；② 选择对抑制剂耐受的聚合酶（KAPA HiFi、Phusion）；③ 必要时上 EK-1103 进行二次纯化。粪便样本对 PCR 抑制极其敏感，任何乙醇残留都会与残留的抑制剂产生叠加效应，导致扩增失败——故 Buffer AW2 漂洗后空管 ~13,400×g 离心 2 min 后必须再开盖室温静置 10 min 彻底晾干。
粪便样品如何取样与保存？
推荐流程：① 新鲜粪便（产出后 ≤30 min）即时分装到无菌管；② 立即 -80℃ 保存或加 EK-5302 RNA Holder-RNA组织保护液/ DNA stabilizer；③ 现场无 -80℃ 时可用便携式干冰盒短期保存；④ 严格避免反复冻融。说明书强调：在使用冷冻粪便时应避免样品在加 Inhibit EX Buffer 前解冻，这会使 DNA 降解。长期室温保存或反复冻融会显著改变菌群组成（厌氧菌损失、兼性厌氧菌相对富集）。
典型得率与微生物多样性表现？
人类粪便 200 mg 典型得率 5–25 μg DNA；小鼠盲肠 100 mg 5–15 μg；牛粪 200 mg 10–40 μg。本试剂盒能保留肠道菌群高多样性。多样性偏差主要来自：① 革兰氏阳性菌破壁不完全；② 严格厌氧菌可能在样品保存过程中失活。
适用哪些动物粪便样品？
广泛兼容：人、小鼠、大鼠、犬、猫、牛、马、猪等哺乳动物粪便；鸟类粪便；反刍动物粪便（牛羊瘤胃微生物分析）；实验小鼠盲肠内容物。规范起始量：180–220 mg。当样品少于 180 mg 也可正常进行（不需减少缓冲液量）。液体样品改为 200 µL，用剪去尖部的枪头吸取；冷冻粪便用手术刀切取 180–220 mg，但严禁在加 Inhibit EX Buffer 前解冻——这会使 DNA 降解。
粪便样品提取的核心难点是什么？
粪便样品含大量 PCR 抑制剂（胆汁酸盐、多糖多酚、食物源成分）。本试剂盒集成 Inhibit EX Buffer 抑制剂去除技术 + Buffer AL 高温裂解（70℃，10 min）+ Proteinase K 蛋白消化 + 硅胶柱纯化（Buffer AW1/AW2 漂洗），可快捷简单地从新鲜或冷冻粪便样本中纯化总 DNA，得到的基因组 DNA 片段大、纯度高、质量稳定可靠，可直接用于 PCR 等下游分子生物学实验。
