EK-1212 FastPure动物粪便基因组提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可快捷简单的从新鲜或冷冻的粪便样本中纯化总DNA。本试剂盒纯化的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒回收的DNA可直接用于PCR等其它分子生物学下游实验。

存储条件

本产品除Proteinase K和RNase A溶液外，可在室温(15~25℃)保存12个月。Proteinase K和RNase A溶液收到后请分装保存于-20℃。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL/2mL离心管

□ 离心机

□ 涡旋仪

□ 水浴锅（将温度调至70℃）

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

□ Inhibit EX Buffer 如有沉淀现象，可37-70℃水浴至完全溶解。

□ Inhibit EX Buffer在存储过程中可能会出现颜色变化（橙色）；这不会影响缓冲区的功能。

□ Buffer AL如有沉淀现象，可70℃水浴至完全溶解。

□ 所有离心均在室温（15-25℃）下完成。

开始前试剂准备

□ Buffer AW1按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇

□ Buffer AW2按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇

DNA浓度及纯度检测

 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯度与浓度。

 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。

 OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH₂O，比值会略低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

操作步骤：

1. 取180-220mg的粪便放入2mL离心管中，并将该管放置在冰上等待使用。后续所有操作应在室温下进行。

当样品少于180mg也可正常进行。在使用少量的粪便时，不需要减少缓冲液的量。如果样品为液体，则将样品量改为200µL（用剪去尖部的枪头能更好的吸取）；如果样品为冷冻的粪便，则用手术刀切取180-220mg，注意在使用冷冻粪便时应避免样品在步骤2加入Inhibit EX Buffer前解冻，这会使DNA降解。

2. 在每个粪便样品中添加1mL Inhibit EX Buffer，涡旋1min或直到样品完全混匀。

彻底涡旋样品很重要，这有助于确保最终洗脱液中的获得最多DNA。

3. 在70℃下水浴加热5min，期间可适当涡旋2-3次，每次涡旋约15s。

提取革兰氏阳性菌或某些寄生虫DNA时，可将温度调至95℃加热10min。若仅提取动物宿主细胞DNA，可跳过此步骤。

4. 最大转速 (~13,400×g)离心3min以沉淀颗粒物，吸取200µL上清液转移至新的2mL离心管中。

转移上清液时应避免吸到任何固体颗粒，如果上清中仍有可见颗粒，应再次离心样品。

5. 在装有200µL上清液的离心管中加入15µL Proteinase K溶液。再加入200µL Buffer AL并涡旋15s使溶液混匀。

注意：Proteinase K溶液不能与Buffer AL先混合，需先后混匀加入。Buffer AL与样品需完全混匀。若需要更高产量，可吸取更多上清液，但后续的Proteinase K、Buffer AL和乙醇需按比例相应增加

6. 70℃下水浴加热10min。

7. （可选步骤）若需去除RNA，加入10µL RNase A Solution（20mg/mL)至溶液中，混匀后室温静置10min。

8. 向离心管中加入200µL的无水乙醇，涡旋混匀。

9. 将上述混匀的溶液转移至吸附柱上，盖上盖子，最大转速 (~13,400×g)离心1min。

如果溶液未完全通过吸附柱，则再次离心直至全部溶液通过吸附柱。

10. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µL Buffer AW1（请先检查是否已加入无水乙醇）至柱子上并以12,000×g离心1min。

11. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µL Buffer AW2（请先检查是否已加入无水乙醇）至柱子中，12,000×g离心1min。

12. 重复操作步骤11一次。

13. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。最大转速 (~13,400×g)离心空柱2min，以甩干柱子的残留物质。(这一步要尽量提高离心速度以减少乙醇的残留)。

注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

14. 将柱子转移至新的1.5mL无菌的离心管，敞开盖子室温静置10min以彻底晾干漂洗液。
注意：粪便样本对 PCR 抑制极其敏感，任何乙醇残留都会与残留的抑制剂产生叠加效应，导致扩增失败。

15. 加入30~100µL预热至70ºC的Buffer ATE至柱子的膜中央，静置2min后以最大转速 (~13,400×g)离心2min收集离心下的基因组DNA。

16. 弃去柱子，将基因组DNA溶液于-20℃保存（短期可保存2-8℃）或进行下游实验。

常见问题：

1. DNA产量低

 样品储存错误：粪便样品建议储存在-20°C或-80°C

 粪便样本在Inhibit EX Buffer中未充分匀浆：用新样品重复DNA纯化过程。 确保将样品和Inhibit EX缓冲液混合，直到样品完全均质

 Buffer AL混匀不充分：用新样品重复DNA纯化程序。确保通过涡旋立即彻底混合样品和Buffer AL

 试剂准备有误：Buffer AW1和Buffer AW2 没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)

2. DNA在下游反应表现不佳

 下游反应中使用的DNA过多：PCR可能会被过量的DNA模板抑制，减少下游反应中使用的DNA量。

 靶细胞裂解效率低下：如果靶细胞难以裂解，如某些细菌和寄生虫，则洗脱液中靶DNA的量可能较低。在未来的准备工作中，根据需要将裂解温度提高至95°C和/或孵育时间。

3. 提取出的 DNA 颜色发黄/发褐

 样本中血红素降解产物或多糖多酚含量极高。减少起始粪便量至100-150mg同时增加一次Buffer AW1的洗涤。