产品描述
产品介绍
分离试剂盒包含一种新颖的专有方法，可利用我们获独有的抑制剂去除技术从环境样本中分离基因组 DNA。该套件适用于腐植酸含量高的环境样品，包括难处理的土壤类型，如堆肥、沉积物和粪便。该套件还成功使用了其他更常见的土壤类型。分离的DNA具有高纯度，可以更成功地从样品中对生物体进行PCR 扩增。已进行PCR分析以检测多种生物体，包括细菌（例如枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌）、真菌（例如酵母、霉菌）、藻类和放线菌（例如链霉菌）。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，得到的DNA杂质少，完整性好，可直接用于PCR、酶切等下游实验。
存储条件
本产品可在室温(15~25℃)干燥保存12个月。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL/2mL离心管
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：
□ 新采集的土壤样本会得到更高的产率，不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。
□ 所有的离心步骤应在室温（15-25℃）下完成。
□ 在需要吸取上清液的步骤中应避免吸到沉淀，否则会堵塞吸附柱，并影响产物纯度。
□ 如果溶液C1出现沉淀，可在37℃-60℃下加热，直到沉淀物溶解。
□ Buffer C4在使用前应震荡混匀。
开始前试剂准备
□ Buffer C5按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
操作步骤：
1. 取750 μL Buffer SP和0.25 g研磨珠至2 mL离心管中。
2. 在上述2 mL离心管中加入土壤样本0.25 g，涡旋混匀15 s。
3. 向样本中加入60 μL Buffer C1，最大速度涡旋振荡10 min至样本充分混匀裂解。
使用前应注意Buffer C1是否出现沉淀，如若出现沉淀，应加热溶解混匀再使用。此步骤为物理破碎和化学裂解结合。使用多管涡旋振荡器可提高效率；若样本纤维质多，可延长至15 min。
4. 常温10,000×g离心30 s，转移上清液至新的2mL离心管中。
离心力不应超过10,000×g，并且离心时应在旁边观察离心机是否能正常运作。如若土壤沉淀效果不佳，可再次10,000×g离心3min。上清液约有400-500μL，可能还会含有一点土壤颗粒。
5. 加入250μL Buffer C2，涡旋5s后4℃放置5min。
注：可以跳过5分钟的孵育。但是为了获得更好的提取效果我们建议您保留该步骤。
6. 10,000×g离心1min，转移上清液（约600μL）至新的2mL离心管中。
此次上清液转移应避免吸到任何颗粒，否则会影响DNA纯度。
7. 加入200μL Buffer C3混匀，4℃放置5min。
注：可以跳过5分钟的孵育。但是为了获得更好的提取效果我们建议您保留该步骤。
8. 10,000×g离心1min，转移上清液（约750μL）至新的2mL离心管中。
此次上清液转移应避免吸到任何颗粒，否则会影响DNA纯度。
9. 加入1.2mL Buffer C4，涡旋5s。
10. 把吸附柱套在2mL收集管中。将上个步骤所得溶液取700μL加入柱中，10,000×g离心1min。离心完后倒掉收集管中的废液。重复该步骤，直到溶液全部完成上柱过滤。
注：由于混合液体积较大（约2mL），通常需要分3次离心上柱。
11. 向吸附柱中加入500μL Buffer C5（使用前确认已加入无水乙醇），10,000×g离心30s，离心完后倒掉收集管中的废液。
12. 向吸附柱中加入500μL 70%乙醇，10,000×g离心30s，离心完后倒掉收集管中的废液。
13. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，12,000×g离心2min以除尽Buffer C5。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管，开盖室温静置5-10 min彻底晾干。
注意：Buffer C5中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。
14. 向吸附柱膜中间位置悬空滴加50-100μL Buffer C6，室温静置2min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。丢弃柱子，盖上离心管盖子置于-20℃保存。
注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了提高DNA的回收量，可将Buffer C6加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。
常见问题：
1. DNA无法扩增
确保通过凝胶电泳或分光光度计读数检查DNA产量和纯度。过量的DNA投入量会抑制PCR反应。
如果尝试上述步骤后DNA仍然无法扩增，则可能需要进行PCR优化（改变反应条件和引物选择）。
2. 浓缩洗脱的DNA
如洗脱DNA的最终体积为100μL，可以通过加入10μL 5M NaCl并颠倒3-5次混匀来浓缩DNA。接下来加入200μL 100%预冷乙醇并颠倒3-5次以混合。在室温 (15-25°C) 下以最大转速 (~13,400×g)离心5分钟。
倒出所有液体。在高速真空吸尘器、干燥器或空气干燥器中除去残留的乙醇。在无菌水或无菌10 mM Tris（pH 8.0）中重悬沉淀的DNA。
3. 加载凝胶时 DNA 从孔中浮出
这通常是因为残留的Buffer C5残留在最终样品中。上述问题2中乙醇沉淀是去除残留Buffer C5的最佳方法。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1210、基因组DNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温(15~25℃)干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 DNA 应如何储存？
短期 4℃（≤1 周）；长期 -20℃ 分装储存。
从沙漠土等贫瘠土壤提取效果差，如何提升？
策略：① 加大起始量到 1 g（多管并联或用大柱规格）；② ③ 减小洗脱体积至 30–50 μL（说明书最低 30 μL）以提升 DNA 浓度；③ 改用 ddPCR 等高灵敏度检测方法。
A260/A230 偏低（<1.5）正常吗？
土壤样品因腐殖酸残留 A260/A230 偏低很常见（通常 1.0–1.7），但 A260/A230 不直接代表 PCR 抑制水平——即使 A260/A230 = 1.0，10 倍稀释后仍可能成功扩增。建议直接以模板稀释曲线（×1, ×10, ×100）验证 PCR 可用性。如需提升 A260/A230，可上 EK-1103 二次纯化或采用上述乙醇沉淀法清理。
提取的 DNA 适合哪些下游应用？
PCR、酶、16S rRNA / ITS 扩增子测序（微生物群落结构分析）、宏基因组 shotgun 测序、qPCR 定量特定菌群、 功能基因（如 nifH、catA）扩增、真菌、古菌、AMF 等多组学分析。
洗脱液浓度低或下游 PCR 抑制怎么办？
PCR 抑制通常由腐殖酸残留导致。优化措施：① 严格按说明书使用 Buffer C2、C3、C5（含乙醇）漂洗，Buffer C5 漂洗后再加 500 μL 70% 乙醇额外漂洗一次（说明书原文要求）；② 上 PCR 前先稀释模板 10–100 倍以稀释抑制剂；③ 选用对腐殖酸耐受的聚合酶（KAPA HiFi、Phusion 等）；④ qPCR 前通过模板稀释曲线判断是否抑制；⑤ 若洗脱液中仍有 Buffer C5 残留，可用乙醇沉淀法浓缩（加 10 μL 5 M NaCl 颠倒 + 200 μL 100% 预冷乙醇颠倒 + ~13,400×g 离心 5 min 弃液 + 干燥后无菌水重悬）。
为什么需要珠磨步骤？
土壤中的微生物多样性巨大，单独化学裂解只能裂解革兰氏阴性菌等易裂解的物种，会造成多样性偏差。本试剂盒集成了 1 mm 研磨珠，Buffer C1 + 最大速度涡旋振荡 10 min实现物理破碎和化学裂解结合。推荐保留 Buffer C2 与 Buffer C3 之后的 4℃ 5 min 孵育步骤——可以跳过 5 分钟的孵育，但是为了获得更好的提取效果我们建议您保留该步骤。
土壤怎么取样与保存？
新采集的土壤样本会得到更高的产率。推荐流程：① 现场用无菌铲取 0–10 cm 表层土，避开石砾；② 即时装入 50 mL 灭菌管，冰盒带回；③ 实验室即时处理或 -80℃ 保存；④ 室温运输尽量 ≤24 小时。避免：反复冻融、长期 -20℃ 保存（>3 个月会有微生物结构降解）。
起始量与典型得率？
① 取 750 μL Buffer SP + 0.25 g 研磨珠至 2 mL 离心管；② 加入 0.25 g 土壤样本，涡旋混匀 15 s；③ 加 60 μL Buffer C1，最大速度涡旋振荡 10 min至样本充分混匀裂解（若样本纤维质多可延长至 15 min）；④ 10000×g 离心 30 s 取上清。典型得率：一般农田土 5–25 μg；森林土 10–40 μg；沙漠土/贫瘠土 0.5–3 μg；泥炭土 5–15 μg。
适用哪些样品类型？
堆肥、沉积物、粪便、各类农田土、森林土等。难处理的土壤类型也可处理。新采集的土壤样本会得到更高的产率，不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。若处理动物粪便专项，请优先使用 EK-1212。
本试剂盒为什么需要专门的「土壤」配方？
土壤样品提取最大的难点是腐殖酸（humic acid）、富里酸、单宁等会与 DNA 共沉淀，且后续严重抑制 PCR。本试剂盒采用专有的抑制剂去除技术 + 多步缓冲液（Buffer SP/C1/C2/C3/C4/C5/C6）+ 1 mm 研磨珠物理破碎 + 硅胶柱纯化组合，特别适用于腐殖酸含量高的环境样品（堆肥、沉积物、粪便、难处理土壤类型）。已经过 PCR 分析验证可检测细菌（枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌）、真菌（酵母、霉菌）、藻类、放线菌（链霉菌）等多种生物。
