EK-1210 FastPure土壤微生物DNA小量提取试剂盒

产品介绍

分离试剂盒包含一种新颖的专有方法，可利用我们获独有的抑制剂去除技术从环境样本中分离基因组 DNA。该套件适用于腐植酸含量高的环境样品，包括难处理的土壤类型，如堆肥、沉积物和粪便。该套件还成功使用了其他更常见的土壤类型。分离的DNA具有高纯度，可以更成功地从样品中对生物体进行PCR 扩增。已进行PCR分析以检测多种生物体，包括细菌（例如枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌）、真菌（例如酵母、霉菌）、藻类和放线菌（例如链霉菌）。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，得到的DNA杂质少，完整性好，可直接用于PCR、酶切等下游实验。

存储条件

本产品可在室温(15~25℃)干燥保存12个月。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL/2mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：

□ 新采集的土壤样本会得到更高的产率，不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。

□ 所有的离心步骤应在室温（15-25℃）下完成。

□ 在需要吸取上清液的步骤中应避免吸到沉淀，否则会堵塞吸附柱，并影响产物纯度。

□ 如果溶液C1出现沉淀，可在37℃-60℃下加热，直到沉淀物溶解。

□ Buffer C4在使用前应震荡混匀。

开始前试剂准备

□ Buffer C5按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇

操作步骤：

1. 取750 μL Buffer SP和0.25 g研磨珠至2 mL离心管中。

2. 在上述2 mL离心管中加入土壤样本0.25 g，涡旋混匀15 s。

3. 向样本中加入60 μL Buffer C1，最大速度涡旋振荡10 min至样本充分混匀裂解。

使用前应注意Buffer C1是否出现沉淀，如若出现沉淀，应加热溶解混匀再使用。此步骤为物理破碎和化学裂解结合。使用多管涡旋振荡器可提高效率；若样本纤维质多，可延长至15 min。

4. 常温10,000×g离心30 s，转移上清液至新的2mL离心管中。

离心力不应超过10,000×g，并且离心时应在旁边观察离心机是否能正常运作。如若土壤沉淀效果不佳，可再次10,000×g离心3min。上清液约有400-500μL，可能还会含有一点土壤颗粒。

5. 加入250μL Buffer C2，涡旋5s后4℃放置5min。

注：可以跳过5分钟的孵育。但是为了获得更好的提取效果我们建议您保留该步骤。

6. 10,000×g离心1min，转移上清液（约600μL）至新的2mL离心管中。

此次上清液转移应避免吸到任何颗粒，否则会影响DNA纯度。

7. 加入200μL Buffer C3混匀，4℃放置5min。

注：可以跳过5分钟的孵育。但是为了获得更好的提取效果我们建议您保留该步骤。

8. 10,000×g离心1min，转移上清液（约750μL）至新的2mL离心管中。

此次上清液转移应避免吸到任何颗粒，否则会影响DNA纯度。

9. 加入1.2mL Buffer C4，涡旋5s。

10. 把吸附柱套在2mL收集管中。将上个步骤所得溶液取700μL加入柱中，10,000×g离心1min。离心完后倒掉收集管中的废液。重复该步骤，直到溶液全部完成上柱过滤。
注：由于混合液体积较大（约2mL），通常需要分3次离心上柱。

11. 向吸附柱中加入500μL Buffer C5（使用前确认已加入无水乙醇），10,000×g离心30s，离心完后倒掉收集管中的废液。

12. 向吸附柱中加入500μL 70%乙醇，10,000×g离心30s，离心完后倒掉收集管中的废液。

13. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，12,000×g离心2min以除尽Buffer C5。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管，开盖室温静置5-10 min彻底晾干。

注意：Buffer C5中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。

14. 向吸附柱膜中间位置悬空滴加50-100μL Buffer C6，室温静置2min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。丢弃柱子，盖上离心管盖子置于-20℃保存。

注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH₂O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了提高DNA的回收量，可将Buffer C6加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。

常见问题：

1. DNA无法扩增

 确保通过凝胶电泳或分光光度计读数检查DNA产量和纯度。过量的DNA投入量会抑制PCR反应。

 如果尝试上述步骤后DNA仍然无法扩增，则可能需要进行PCR优化（改变反应条件和引物选择）。

2. 浓缩洗脱的DNA

 如洗脱DNA的最终体积为100μL，可以通过加入10μL 5M NaCl并颠倒3-5次混匀来浓缩DNA。接下来加入200μL 100%预冷乙醇并颠倒3-5次以混合。在室温 (15-25°C) 下以最大转速 (~13,400×g)离心5分钟。

 倒出所有液体。在高速真空吸尘器、干燥器或空气干燥器中除去残留的乙醇。在无菌水或无菌10 mM Tris（pH 8.0）中重悬沉淀的DNA。

3. 加载凝胶时 DNA 从孔中浮出

 这通常是因为残留的Buffer C5残留在最终样品中。上述问题2中乙醇沉淀是去除残留Buffer C5的最佳方法。