产品描述
产品介绍
本产品适合于从5×107培养真菌样品中提取总DNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需30~60min。得到的DNA可直接用于PCR、Southern Blot等实验。
存储条件
本产品除Proteinase K Solution和Lyticase Solution外，可在室温(15~25℃)保存12个月。Proteinase K Solution和Lyticase Solution请分装保存于-20℃。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL离心管
□ 异丙醇
□ 20mg/mL RNase A溶液
□ PBS
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
□ 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
□ 若Buffer BB或Buffer IRB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
□ 水浴锅温度设置至70℃。
开始前试剂准备
□ Buffer IRB按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
□ Buffer WB按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
操作步骤：
1. 取200μL真菌菌液（最多不超过5×107cells）于无酶1.5mL离心管中。
2. 10000×g离心1min或3000×g离心5min收集真菌沉淀。
3. 加入200μL无菌PBS将真菌重悬。
注意：为尽可能减少LB等真菌培养基对提取过程中的影响，可重复步骤2-3一次。
4. 加入10μL Lyticase Solution至溶液中，充分涡旋混匀15-20s后37℃孵育30-60min。
注意：过量的真菌细胞会导致破壁酶破壁效果不好，如若发现提取效果不好时，可适当增加破壁酶溶液量。对于一些难裂解的真菌（如丝状真菌或含有色素的真菌），孵育时间可延长至1-2小时。若有条件，辅助使用液氮研磨将显著提高得率。
5. （可选）加入5μL RNase A Solution(20mg/mL，自备）至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置5-10min。
6. 将所得溶液加入200μL Buffer BB并充分混匀，加入20μLProteinase K Solution后立即混匀，彻底混匀后置于70℃水浴中孵育10min。
7. 将溶液从水浴中取出，并加入100μL 异丙醇充分混匀。
加入异丙醇后，可能会出现丝状或云雾状 DNA 析出，这属于正常现象。
8. 于13000×g离心5min，离心结束后取上清溶液加入核酸吸附柱（提前套在2mL收集管中）。
加入异丙醇后应立即充分颠倒混匀。离心后取上清液时，请勿触碰底部的沉淀物，以防止杂质堵塞吸附柱。
9. 以8000×g离心1min，离心完后倒掉收集管中的废液。
10. 向吸附柱中加入500μL Buffer IRB，8000×g离心1min，离心完后倒掉收集管中的废液。
11. 向吸附柱中加入500μL Buffer WB（已加入无水乙醇），8000×g离心1min，离心完后倒掉收集管中的废液。
12. 重复操作步骤11一次。
13. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心2min 以除尽Buffer WB。将吸附柱套入新的1.5mL无酶离心管中并开盖置于室温放置5-10min彻底晾干乙醇。
注意：Buffer WB中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。
14. 向吸附柱膜中间位置悬空滴加50-100μL Buffer EB，室温静置2min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集核酸溶液。丢弃柱子，盖上离心管盖子置于-20℃保存。
注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。为了提高DNA的回收量，可将Buffer EB加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。
常见问题：
1. 柱子堵塞
样品用量太多:减少样品用量。真菌细胞量应控制在5×107以内。
样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer BB及蛋白酶K后充分涡旋混匀。
2. DNA纯度不达标：
样品用量太多：减小用量。
某些真菌会产生大量的多糖或次生代谢产物：可减少起始样本量；或在加入Buffer BB裂解后，增加一次12000×g离心3 min取上清的操作，再进入异丙醇沉淀步骤。
3. DNA产量低
试剂准备有误：检查Buffer IRB和Buffer WB中是否加入无水乙醇。
样品消化不充分: 用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。
洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1209、基因组DNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温(15~25℃)保存
常见问题 (FAQ)
提取的 DNA 应如何储存？
短期 4℃（1 周内）；长期 -20℃ 分装储存。色素含量高的样品应避光保存。
柱子堵塞或 DNA 产量低如何排查？
① 柱子堵塞——样品用量太多（真菌细胞量应控制在 5×10⁷ 以内）/样品裂解不充分（重新提取，加 Buffer BB 及 Proteinase K 后充分涡旋混匀）；② DNA 纯度不达标——样品用量太多（减小用量）/某些真菌会产生大量的多糖或次生代谢产物（在加 Buffer BB 裂解后增加一次 12000×g 离心 3 min 取上清的操作）；③ DNA 产量低——试剂准备有误（检查 Buffer IRB 和 Buffer WB 中是否加入无水乙醇）/样品消化不充分（液氮研磨、延长 Proteinase K 消化或过夜消化）/洗脱不充分（洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数）。
分生孢子（conidia）DNA 提取效果差，如何优化？
分生孢子壁极厚且疏水。优化建议：① 必须使用机械破碎（锆珠 0.1 mm + 球磨仪 30 Hz × 3 min）；② Lyticase 用量加倍至 20 μL，孵育延长至 2 h；③ 加热-冻融循环 3 次（液氮 ↔ 65℃ 各 2 min）；④ 在裂解液中加 SDS（1%）+ β-巯基乙醇（1%）。
提取的 DNA 适合哪些下游应用？
PCR、Southern Blot 、ITS / 18S rRNA 测序进行真菌鉴定、基因克隆、CRISPR 编辑（适用于酵母与可改造丝状真菌）、二代测序文库（WGS、ITS 高通量测序）等下游实验。
OD260/OD280 偏低或洗脱液发黄怎么办？
真菌样品常含色素（黑曲霉、真菌孢子色素）与多糖（甘露聚糖、葡聚糖），可能导致 OD260/OD280 <1.7 或洗脱液发黄。某些真菌会产生大量的多糖或次生代谢产物：可减少起始样本量；或在加入 Buffer BB 裂解后，增加一次 12000×g 离心 3 min 取上清的操作，再进入异丙醇沉淀步骤。额外建议：上柱前氯仿:异戊醇(24:1)萃取一次；增加 Buffer WB 漂洗次数；必要时加 PVP-40（1%）吸附多酚。
丝状真菌的样品准备有哪些注意？
丝状真菌处理流程：① 在固体培养基上铺玻璃纸培养 3–7 天，刮取菌丝（避免培养基污染）；② 液氮预冷研磨成细粉；③ 转入 PBS 重悬后加 Lyticase 37℃ 孵育，按说明书延长至 1–2 h；④ 必要时加玻璃珠球磨补强。研磨不细是低得率最常见原因。
难裂解真菌（如丝状真菌、含色素真菌）如何优化？
对于一些难裂解的真菌（如丝状真菌或含有色素的真菌），孵育时间可延长至 1–2 小时。若有条件，辅助使用液氮研磨将显著提高得率：① 物理破壁加 0.5 mm 玻璃珠或 0.1 mm 锆珠球磨 30 Hz × 2–3 min；② 在裂解液中加 SDS（1%）+ β-巯基乙醇（1%）促进破壁；③ 必要时加热-冻融循环 3 次。
Lyticase 用量与孵育条件？
① 取 200 μL 真菌菌液（≤5×10⁷ cells）→ PBS 重悬；② 加 10 μL Lyticase Solution，涡旋 15–20 s 后 37℃ 孵育 30–60 min；③ 加 200 μL Buffer BB + 20 μL Proteinase K 混匀，70℃ 水浴 10 min；④ 加 100 μL 异丙醇充分混匀；⑤ 13000×g 离心 5 min 取上清上柱。过量的真菌细胞会导致破壁酶破壁效果不好，若发现提取效果不好时，可适当增加破壁酶溶液量。
起始量与典型得率是多少？
起始量 200 μL 真菌菌液（最多不超过 5×10⁷ cells）。S. cerevisiae 5×10⁷ 细胞典型得率 5–15 μg；丝状真菌 50 mg 菌丝 3–10 μg；分生孢子（1×10⁶）0.5–2 μg。为尽可能减少培养基对提取过程的影响，可重复 PBS 洗涤一次。
本试剂盒针对真菌的核心设计是什么？
真菌细胞壁富含几丁质、β-葡聚糖、甘露蛋白，结构远比细菌厚实。本试剂盒集成了 Lyticase Solution（25 mg/mL）破壁酶 + Buffer BB 化学裂解 + Proteinase K + 异丙醇沉淀，无需酚氯仿即可在 30–60 min 内完成总 DNA 提取。流程对酵母（Saccharomyces, Candida）、丝状真菌（Aspergillus, Fusarium）均适用。
