EK-1208 FastPure细菌基因组DNA提取试剂盒

产品介绍

本产品适合于从1×10⁹培养细菌样品中提取总DNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需30~60min。得到的DNA可直接用于PCR、Southern Blot等实验。

存储条件

本产品除Proteinase K Solution和Lysozyme Solution外，可在室温(15~25℃)保存12个月。Proteinase K Solution和Lysozyme Solution请分装保存于-20℃。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

□ 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

□ 若Buffer BB或Buffer IRB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

□ 水浴锅温度设置至70℃。

开始前试剂准备

□ Buffer IRB按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇

□ Buffer WB按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇

操作步骤：

1. 取200μL细菌菌液（最多不超过1×10⁹cells）于无酶1.5mL离心管中。

2. 10000×g离心1min或3000×g离心5min收集细菌沉淀。

3. 加入200μL无菌PBS将细菌重悬。

对于在丰富培养基中生长的细菌，建议重复步骤2-3洗涤两次，以去除残留杂质。

4. 加入30μL Lysozyme Solution至溶液中，充分涡旋混匀15-20s后37℃孵育15-30min。

对于革兰氏阳性菌，若发现裂解不彻底，可将孵育时间延长至60 min或适当增加溶菌酶用量。

5. （可选）加入5μL RNase A Solution(20mg/mL，自备）至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置5-10min。

6. 将所得溶液加入200μL Buffer BB并充分混匀，加入20μL Proteinase K Solution后立即混匀，彻底混匀后置于70℃水浴中孵育10min。
水浴结束后，简短离心以收集管盖冷凝水。

7. 将溶液从水浴中取出，并加入100μL异丙醇充分混匀。
加入异丙醇后应立即充分混匀，若产生丝状沉淀属于正常现象。

8. 于13000×g离心5min，吸取上清转移至核酸吸附柱中（提前套在2mL收集管中）。

9. 以8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

10. 向吸附柱中加入500μL Buffer IRB，8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

11. 向吸附柱中加入500μL Buffer WB（已加入无水乙醇），8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

12. 重复操作步骤11一次。

13. 倒弃废液，最大转速 (~13,400×g)离心2 min。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管，开盖室温静置5-10 min以彻底挥发残留乙醇。

注意：Buffer WB中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。

14. 向吸附柱膜中间位置悬空滴加50-100μL Buffer EB，室温静置2min后，最大转速(~13,400×g)离心2min收集核酸溶液。丢弃柱子，盖上EP 管盖子置于-20℃保存。

注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。为了提高DNA的回收量，可将Buffer EB加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。

常见问题：

1. 柱子堵塞

 样品用量太多:减少样品用量。细菌细胞量应控制在1×10⁹以内。

 样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer BB及蛋白酶K后充分涡旋混匀。

2. DNA纯度不达标：

 样品用量太多：减小用量。

3. DNA产量低

 试剂准备有误：检查Buffer IRB和Buffer WB中是否加入无水乙醇。

 样品消化不充分: 用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。

 洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。