产品描述
产品介绍
本产品适合于从1×109培养细菌样品中提取总DNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需30~60min。得到的DNA可直接用于PCR、Southern Blot等实验。
存储条件
本产品除Proteinase K Solution和Lysozyme Solution外，可在室温(15~25℃)保存12个月。Proteinase K Solution和Lysozyme Solution请分装保存于-20℃。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL离心管
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
□ 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
□ 若Buffer BB或Buffer IRB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
□ 水浴锅温度设置至70℃。
开始前试剂准备
□ Buffer IRB按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
□ Buffer WB按瓶子标签所示提前加入相应体积的无水乙醇
操作步骤：
1. 取200μL细菌菌液（最多不超过1×109cells）于无酶1.5mL离心管中。
2. 10000×g离心1min或3000×g离心5min收集细菌沉淀。
3. 加入200μL无菌PBS将细菌重悬。
对于在丰富培养基中生长的细菌，建议重复步骤2-3洗涤两次，以去除残留杂质。
4. 加入30μL Lysozyme Solution至溶液中，充分涡旋混匀15-20s后37℃孵育15-30min。
对于革兰氏阳性菌，若发现裂解不彻底，可将孵育时间延长至60 min或适当增加溶菌酶用量。
5. （可选）加入5μL RNase A Solution(20mg/mL，自备）至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置5-10min。
6. 将所得溶液加入200μL Buffer BB并充分混匀，加入20μL Proteinase K Solution后立即混匀，彻底混匀后置于70℃水浴中孵育10min。
水浴结束后，简短离心以收集管盖冷凝水。
7. 将溶液从水浴中取出，并加入100μL异丙醇充分混匀。
加入异丙醇后应立即充分混匀，若产生丝状沉淀属于正常现象。
8. 于13000×g离心5min，吸取上清转移至核酸吸附柱中（提前套在2mL收集管中）。
9. 以8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入500μL Buffer IRB，8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
11. 向吸附柱中加入500μL Buffer WB（已加入无水乙醇），8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
12. 重复操作步骤11一次。
13. 倒弃废液，最大转速 (~13,400×g)离心2 min。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管，开盖室温静置5-10 min以彻底挥发残留乙醇。
注意：Buffer WB中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。
14. 向吸附柱膜中间位置悬空滴加50-100μL Buffer EB，室温静置2min后，最大转速(~13,400×g)离心2min收集核酸溶液。丢弃柱子，盖上EP 管盖子置于-20℃保存。
注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。为了提高DNA的回收量，可将Buffer EB加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。
常见问题：
1. 柱子堵塞
样品用量太多:减少样品用量。细菌细胞量应控制在1×109以内。
样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer BB及蛋白酶K后充分涡旋混匀。
2. DNA纯度不达标：
样品用量太多：减小用量。
3. DNA产量低
试剂准备有误：检查Buffer IRB和Buffer WB中是否加入无水乙醇。
样品消化不充分: 用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。
洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1208、基因组DNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温(15~25℃)保存
常见问题 (FAQ)
提取的 DNA 应如何储存？
短期 4℃（1 周内）；长期 -20℃ 分装储存（每管单次用量），
柱子堵塞或 DNA 产量低如何排查？
① 柱子堵塞——样品用量太多（细菌细胞量应控制在 1×10⁹ 以内）/样品裂解不充分（重新提取，加 Buffer BB 及 Proteinase K 后充分涡旋混匀）；② DNA 产量低——试剂准备有误（检查 Buffer IRB 和 Buffer WB 中是否加入无水乙醇，乙醇浓度应控制在 80%）/样品消化不充分（液氮研磨、延长 Proteinase K 消化或过夜消化）/洗脱不充分（洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数）。
DNA 完整性差（主带 <20 kb）说明什么？
样品应避免反复冻融，否则会导致提取的 DNA 片段较小且提取量下降。其他原因：① 70℃ 孵育时间延长（>1 h 会有降解风险）；② 涡旋震荡过度——异丙醇沉淀步骤说明书要求加入异丙醇后应立即充分混匀，若产生丝状沉淀属于正常现象，混匀后立即 13000×g 离心 5 min；③ 样品来源含 DNase 活性。建议：操作温和、即取即用。
从冻存菌或甘油菌如何提取？
冻存菌：先用 PBS 或新鲜 LB 洗 1 次去除甘油（甘油会干扰柱结合）；甘油保藏菌：取 50–100 μL 接种到 3–5 mL 液体培养基复活，37℃ 培养 4–8 h 至 OD600 ≥1.0 后再提取，得率与新鲜过夜培养相当。注意：样品应避免反复冻融，否则会导致提取的 DNA 片段较小且提取量下降。
可以从复杂样品（如发酵液、酸奶、土壤悬液）中提取细菌 DNA 吗？
本试剂盒针对纯菌培养优化。复杂样品建议：① 先离心收集菌体并用 PBS 洗涤 2–3 次；② 含食物基质或大颗粒物的样品先 100 μm 过滤；③ 含高量蛋白（如发酵液）增加 Proteinase K 量；④ 若直接处理土壤、粪便等环境样品，优先选择 EK-1210（土壤）或 EK-1212（粪便）等含抑制剂去除技术的专用试剂盒。
提取的 DNA 适合哪些下游应用？
PCR、Southern Blot 等下游实验。扩展应用：菌种鉴定（16S rRNA / ITS 测序）、基因克隆、CRISPR 编辑、二代/三代细菌全基因组测序（WGS）、qPCR 定量。基因组 DNA 主带 ≥30 kb，足够 Illumina 短读长文库与 ONT 长读长测序（>100 kb 文库需特殊保留 HMW DNA 协议）。
OD260/OD280 比值偏低怎么办？
本试剂盒提取的 gDNA OD260/OD280 理想范围为 1.7–2.0（与试剂盒整体设计一致）。比值低提示蛋白污染。说明书故障排查：样品用量太多——减小用量；样品消化不充分——用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长 Proteinase K 消化时间或过夜消化。额外建议：① 严格按说明书 70℃ 水浴 10 min 充分消化；② 增加 Buffer WB（含乙醇）漂洗次数。
阳性菌细胞壁难裂解时如何优化？
革兰氏阳性菌可将 Lysozyme 孵育时间延长至 60 min 或适当增加溶菌酶用量。针对特殊物种的进一步策略：① Mycobacterium：加 muramidase 在 37℃ 处理 1 小时；② Streptococcus：使用 mutanolysin（500 U/mL）；③ 抗酸性细菌：必要时加机械破碎（玻璃珠或锆珠 + 球磨仪 30 Hz × 2 min）；④ 通用方法：在 70℃ 水浴前增加一次 100℃ 短暂加热 5 min（heat shock）助破壁。
起始菌液体积与典型得率是多少？
起始量 200 μL 菌液（最多不超过 1×10⁹ cells）。E. coli 1×10⁹ 细胞典型得率约 20–40 μg gDNA；Bacillus 等阳性菌 5–15 μg；难裂解的 Mycobacterium、Lactobacillus 2–10 μg。对于在丰富培养基中生长的细菌，建议重复 PBS 洗涤两次以去除残留杂质。离心收集采用 10000×g 离心 1 min 或 3000×g 离心 5 min。
本试剂盒同时适用于革兰氏阳性菌和阴性菌吗？
适用。本试剂盒在标准流程中集成了 Lysozyme Solution（50 mg/mL）做溶菌酶预处理：取 200 μL 菌液（≤1×10⁹ cells）→ 离心 + PBS 重悬 → 加 30 μL Lysozyme Solution，37℃ 孵育 15–30 min（革兰氏阳性菌如发现裂解不彻底，可延长至 60 min 或适当增加溶菌酶用量）→ 加 Buffer BB + Proteinase K → 70℃ 水浴 10 min → 加异丙醇沉淀。该流程对革兰氏阴性菌（E. coli、Pseudomonas）和阳性菌（Bacillus、Lactobacillus）都适用。
