EK-1204 FastPure动物组织/细胞基因组小量提取试剂盒

产品介绍

本产品适合于从5~50mg动物组织或小于5×10⁶培养细胞样品中提取总DNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需30~60min。得到的DNA可直接用于PCR/Southern Blot检测等实验。

存储条件

本产品除Proteinase K Solution和RNase A Solution外，可在室温(15~25℃)保存12个月。低温下Buffer GL或Buffer GE可能会有沉淀形成，使用时需55℃水浴让沉淀完全溶解。Proteinase K溶液和RNase A溶液收到后请分装保存于-20℃。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：

□ 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

□ 若Buffer GL或Buffer GE中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

□ Proteinase K Solution和RNase A Solution建议分装保存于-20℃，反复冻融会影响其活性。

□ 小型高速离心机（~13000rpm）

□ 水浴锅温度分别设置至56℃和70℃。

开始前试剂准备

□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer GW，于室温密封保存。

操作步骤：

1. 请根据样品种类进行以下步骤（A为培养细胞，B为动物组织）

A. 培养细胞的消化裂解（细胞总量≤5×10⁶个）

（1）细胞消化完成后将细胞消化混合液2300×g离心1min收集细胞，小心移去培养液留下白色细胞沉淀。

（2）加入1mL PBS溶液重悬细胞，2300×g离心1min，吸去上清溶液留下细胞沉淀。

（3）加入40µL PBS溶液，用移液器吹打以重悬细胞。

（4）加入100µL Buffer GL，涡旋15s彻底混匀。

（5）加入10µL Proteinase K溶液（20mg/mL）至样品中，再次涡旋15s。

（6）将样品置于56℃水浴15min，然后70℃水浴2min。

（7）（可选）加入5µL RNase A Solution至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置15min。

B. 动物组织的消化裂解（5~50mg）

（1）把5~50mg组织研磨或剪成尽量小的碎片，转移至1.5mL 离心管中。按顺序分别加入50µL 1×PBS、50µL Buffer GL和10µL Proteinase K溶液(20mg/mL)，涡旋混匀15s。56℃水浴30-60min（若组织块过大或消化慢可延长消化时间，最长可过夜），期间需颠倒混匀几次或震荡水浴。

注意：适当的组织量才能获得理想结果。过多的样品会降低产量和纯度。脾、肝、肾等富含DNA的样品不宜超过20mg，肌肉和皮肤等可达50mg。肌肉、皮肤、心肌等结缔组织较多的样本，建议使用液氮研磨或机械匀浆，否则消化极慢且容易堵柱。消化时间取决于样品类型和匀浆效果，一般组织样品需0.5-3h，老鼠尾巴需6-8h。过夜消化不影响后续的实验操作及最终结果。

（2）（可选）加入5µL RNase A Solution至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置15min。

RNA消化时间取决于样品类型，肝、肾等富含RNA，需较长消化时间。

2. 加入500µL Buffer GE至消化液中，充分涡旋混匀15-20s后室温静置10min。

注意：消化完成后应无组织碎片残留，若有则12000×g离心3min弃去不溶物再执行步骤2。

3. 把吸附柱套在2mL收集管中。将上一步骤所得溶液加入柱中，12000×g离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

若柱子出现堵塞，可提高转速至14000×g离心3-5min。若总溶液体积超过700µL则分次上柱。

4. 向吸附柱中加入500µL Buffer GE，12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

5. 向吸附柱中加入500µL Buffer GW（确认已加入相应体积无水乙醇），12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 重复步骤5一次。

7. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜。将吸附柱套入新的1.5mL离心管中并置于室温放置5-10min彻底晾干。

注意：Buffer GW中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。

8. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加50-100µL Buffer EB，室温静置2min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液并置于-20℃保存。

注意：洗脱体积不应小于30µL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH₂O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了提高DNA的回收量，可将Buffer EB加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。

常见问题：

1. 柱子堵塞

 样品用量太多:减少样品用量。富含核酸的样品如脾、肝、肺等用量可小于20mg。

 样品消化不充分:用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。

 样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer GL后充分涡旋混匀。

 消化液中存在不溶解物质：若样品消化后存在明显颗粒，于12000×g离心3min弃去不溶物。

2. RNA污染：

 样品RNA含量高：延长RNase消化时间至60min。

3. DNA纯度不达标：

 样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer GL后充分涡旋混匀。

 样品用量太多：减小用量。

 复杂样品：对于一些富含代谢物质组织，样品经裂解消化后，用等体积酚氯仿抽提后再继续操作。

4. DNA产量低

 试剂准备有误：Buffer GW没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

 样品消化不充分:用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。

5. DNA 降解（拖尾严重）

 样品反复冻融或组织取下后未及时处理：取出的组织应立即液氮深冻或存放在RNA/DNA稳定剂（如ES-8735 Simple Protect通用型样本保存液）中。