产品描述
产品介绍
本产品适合于从5~50mg动物组织或小于5×106培养细胞样品中提取总DNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需30~60min。得到的DNA可直接用于PCR/Southern Blot检测等实验。
存储条件
本产品除Proteinase K Solution和RNase A Solution外，可在室温(15~25℃)保存12个月。低温下Buffer GL或Buffer GE可能会有沉淀形成，使用时需55℃水浴让沉淀完全溶解。Proteinase K溶液和RNase A溶液收到后请分装保存于-20℃。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL离心管
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：
□ 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
□ 若Buffer GL或Buffer GE中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
□ Proteinase K Solution和RNase A Solution建议分装保存于-20℃，反复冻融会影响其活性。
□ 小型高速离心机（~13000rpm）
□ 水浴锅温度分别设置至56℃和70℃。
开始前试剂准备
□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer GW，于室温密封保存。
操作步骤：
1. 请根据样品种类进行以下步骤（A为培养细胞，B为动物组织）
A. 培养细胞的消化裂解（细胞总量≤5×106个）
（1）细胞消化完成后将细胞消化混合液2300×g离心1min收集细胞，小心移去培养液留下白色细胞沉淀。
（2）加入1mL PBS溶液重悬细胞，2300×g离心1min，吸去上清溶液留下细胞沉淀。
（3）加入40µL PBS溶液，用移液器吹打以重悬细胞。
（4）加入100µL Buffer GL，涡旋15s彻底混匀。
（5）加入10µL Proteinase K溶液（20mg/mL）至样品中，再次涡旋15s。
（6）将样品置于56℃水浴15min，然后70℃水浴2min。
（7）（可选）加入5µL RNase A Solution至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置15min。
B. 动物组织的消化裂解（5~50mg）
（1）把5~50mg组织研磨或剪成尽量小的碎片，转移至1.5mL 离心管中。按顺序分别加入50µL 1×PBS、50µL Buffer GL和10µL Proteinase K溶液(20mg/mL)，涡旋混匀15s。56℃水浴30-60min（若组织块过大或消化慢可延长消化时间，最长可过夜），期间需颠倒混匀几次或震荡水浴。
注意：适当的组织量才能获得理想结果。过多的样品会降低产量和纯度。脾、肝、肾等富含DNA的样品不宜超过20mg，肌肉和皮肤等可达50mg。肌肉、皮肤、心肌等结缔组织较多的样本，建议使用液氮研磨或机械匀浆，否则消化极慢且容易堵柱。消化时间取决于样品类型和匀浆效果，一般组织样品需0.5-3h，老鼠尾巴需6-8h。过夜消化不影响后续的实验操作及最终结果。
（2）（可选）加入5µL RNase A Solution至消化液中，颠倒混匀，室温或37℃放置15min。
RNA消化时间取决于样品类型，肝、肾等富含RNA，需较长消化时间。
2. 加入500µL Buffer GE至消化液中，充分涡旋混匀15-20s后室温静置10min。
注意：消化完成后应无组织碎片残留，若有则12000×g离心3min弃去不溶物再执行步骤2。
3. 把吸附柱套在2mL收集管中。将上一步骤所得溶液加入柱中，12000×g离心1min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
若柱子出现堵塞，可提高转速至14000×g离心3-5min。若总溶液体积超过700µL则分次上柱。
4. 向吸附柱中加入500µL Buffer GE，12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入500µL Buffer GW（确认已加入相应体积无水乙醇），12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
6. 重复步骤5一次。
7. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜。将吸附柱套入新的1.5mL离心管中并置于室温放置5-10min彻底晾干。
注意：Buffer GW中的乙醇残留会影响后续的酶反应实验。
8. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加50-100µL Buffer EB，室温静置2min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液并置于-20℃保存。
注意：洗脱体积不应小于30µL，体积过少会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了提高DNA的回收量，可将Buffer EB加热（约60℃）并洗脱两次，可增加约15-20%得率。
常见问题：
1. 柱子堵塞
样品用量太多:减少样品用量。富含核酸的样品如脾、肝、肺等用量可小于20mg。
样品消化不充分:用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。
样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer GL后充分涡旋混匀。
消化液中存在不溶解物质：若样品消化后存在明显颗粒，于12000×g离心3min弃去不溶物。
2. RNA污染：
样品RNA含量高：延长RNase消化时间至60min。
3. DNA纯度不达标：
样品裂解不充分：重新提取，加入Buffer GL后充分涡旋混匀。
样品用量太多：减小用量。
复杂样品：对于一些富含代谢物质组织，样品经裂解消化后，用等体积酚氯仿抽提后再继续操作。
4. DNA产量低
试剂准备有误：Buffer GW没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。
样品消化不充分:用液氮或研磨仪可提高样品消化效果，延长Proteinase K消化时间或过夜消化。
5. DNA 降解（拖尾严重）
样品反复冻融或组织取下后未及时处理：取出的组织应立即液氮深冻或存放在RNA/DNA稳定剂（如ES-8735 Simple Protect通用型样本保存液）中。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1204、基因组DNA提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温(15~25℃)保存
常见问题 (FAQ)
提取的 DNA 应如何储存？
短期 4℃（1–2 周）；长期 -20℃ 或 -80℃ 分装储存。
可以从极小起始量（如组织针穿刺活检）提取 DNA 吗？
本试剂盒最小处理量约 1×10⁴ 细胞或 1 mg 组织；低于此推荐使用 micro 规格的微量基因组 DNA 试剂盒。极少量样品建议：① 减小洗脱体积至 30 µL（说明书最低洗脱量，再低会影响回收效率）；② 后续用 WGA 全基因组扩增放大模板量。
DNA 纯度不达标或产量低如何排查？
① DNA 纯度不达标——样品裂解不充分（重新提取，加 Buffer GL 后充分涡旋）/样品用量太多（减小用量）/复杂样品（如富代谢物组织，可在裂解消化后用等体积酚氯仿抽提一次）；② DNA 产量低——试剂准备有误（检查 Buffer GW 是否按瓶身指示加足无水乙醇，乙醇浓度 ~80%）/样品消化不充分（液氮研磨、延长 Proteinase K 消化或过夜消化）；③ RNA 污染——延长 RNase 消化时间至 60 min。
用于 NGS 二代测序文库构建的样品要求是什么？
本试剂盒纯化的 DNA 适用于 PCR、Southern Blot 检测等下游实验，可用于二代测序文库构建。建议：用 Qubit 而非 NanoDrop 测定浓度（更准确），并通过琼脂糖凝胶或 TapeStation 检查完整性。OD260/OD280 应为 1.7–2.0（说明书指标）。如需 >100 kb 高分子量 DNA（如 Oxford Nanopore 或 PacBio HiFi），建议使用专用 HMW DNA 提取试剂盒。
从培养细胞提取 DNA 有哪些注意事项？
① 细胞总量 ≤5×10⁶ 个，过载会降低得率；② 细胞需先 PBS 洗涤 1–2 次以去除培养基蛋白；③ 贴壁细胞推荐胰酶消化收集而非直接刮取；④ 细胞 pellet 可立即裂解或 -80℃ 短期保存；⑤ 病毒感染细胞建议在生物安全柜内裂解。
提取的 DNA 完整性如何？
正常操作下基因组 DNA 主带集中在 ≥30 kb（琼脂糖凝胶电泳）。样品反复冻融会导致提取的 DNA 片段较小且提取量下降。建议：① 取出的组织应立即液氮深冻或存放在 RNA/DNA 稳定剂（如 ES-8735 Simple Protect 通用型样本保存液）中；② 操作温和、避免剧烈涡旋；③ 消化温度严格控制 56℃。
为什么我的组织样品消化后还有可见碎片？
消化完成后应无组织碎片残留，若有则 12000×g 离心 3 min 弃去不溶物再继续上柱步骤。常见原因：① Proteinase K 量不足或活性下降（保存不当——本试剂盒推荐 -20℃ 分装保存避免反复冻融）；② 56℃ 时间不够；③ 组织块过大；④ 富含结缔组织（皮肤、肌腱）需更长消化时间。解决：用液氮或研磨仪提高样品消化效果，延长 Proteinase K 消化时间或过夜消化；裂解不充分时重新提取，加入 Buffer GL 后充分涡旋混匀。
从培养细胞如何提取 DNA？
培养细胞流程（细胞总量 ≤5×10⁶ 个）：① 细胞消化后 2300×g 离心 1 min 收集细胞，吸去培养液留白色细胞沉淀；② 加 1 mL PBS 重悬，2300×g 离心 1 min 弃上清；③ 加 40 µL PBS 重悬细胞；④ 加 100 µL Buffer GL 涡旋 15 s 彻底混匀；⑤ 加 10 µL Proteinase K 溶液（20 mg/mL）再次涡旋 15 s；⑥ 56℃ 水浴 15 min，然后 70℃ 水浴 2 min；⑦（可选）加 5 µL RNase A 溶液室温或 37℃ 放置 15 min。
组织样品如何破碎以提高裂解效率？
说明书明确指出：肌肉、皮肤、心肌等结缔组织较多的样本，建议使用液氮研磨或机械匀浆，否则消化极慢且容易堵柱。推荐流程：① 取 5–50 mg 组织研磨或剪成尽量小的碎片；② 按顺序加入 50 µL 1×PBS、100 µL Buffer GL、10 µL Proteinase K 溶液(20 mg/mL)，涡旋混匀 15 s；③ 56℃ 水浴 30–60 min（组织块过大或消化慢可延长，最长可过夜，老鼠尾巴需 6–8 h）；④ 期间颠倒混匀几次或用震荡水浴。注意：脾、肝、肾等富 DNA 样品不宜超过 20 mg，肌肉和皮肤可达 50 mg。过多样品反而会降低产量和纯度。
本试剂盒适用于哪些样品类型？
本试剂盒适合从 5–50 mg 动物组织或 ≤5×10⁶ 培养细胞样品中提取总 DNA，整个过程仅需 30–60 min，无需酚氯仿抽提与醇类沉淀。涵盖样品类型：① 动物组织（鼠尾、肝、肾、脑、心、脾、肌肉等新鲜或冻存组织）；② 培养细胞（贴壁或悬浮）；③ 解剖样品的小切片。不适用：FFPE 切片（请用 EK-1217）。
