EK-1201 FastPure血液基因组提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒适用于哺乳动物血液核酸提取，不含苯酚等有毒化学试剂组分，采用独特的缓冲液配方Buffer IRB最大限度去除血液抑制剂的影响，同时应用先进的硅胶膜吸附技术，操作简单、快速。得到的DNA 比传统试剂盒纯度更高，可直接用于酶切、转化、测序及PCR 等分子生物学实验。

存储条件

本产品除Proteinase K溶液和RNase溶液外，其余试剂可在室温(15-25℃)保存12个月。低温下Buffer BL或Buffer IRB可能会有沉淀形成，使用时需55℃水浴让沉淀完全溶解。Proteinase K溶液和RNase A溶液冰袋运输，收到产品后请分装保存于-20℃。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5/2mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

● Buffer BL和Buffer IRB是如有混浊现象，可在55℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

● 基因组提取所有步骤都在室温（15-25°C）下进行。

● 样本要求：本试剂盒首选EDTA抗凝血（通常为紫色盖真空管）。亦可使用柠檬酸钠（ACD/枸橼酸钠）抗凝血。严禁或不建议使用肝素抗凝血（通常为绿色盖真空管），因为残留的肝素会严重抑制下游PCR扩增及酶促反应。

开始前试剂准备

□ 按瓶子标签所示，Buffer IRB及Buffer BW中加入指定体积的无水乙醇稀释，于室温密封保存。

DNA浓度及纯度检测

l 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯度与浓度。

l DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。

l OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH₂O，比值会略低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

应用领域

适合于从约10μL-1mL抗凝血液、血清、血浆、尿液、或其它体液样品中直接提取总DNA。获得的DNA包括了基因组 DNA(如淋巴细胞、线粒体DNA、游离的DNA(>100bp)、以及病毒DNA(如乙肝)等；

操作步骤：

1. 转移250μL抗凝的血液，血清，血浆或其它体液样品至蛋白酶的离心管中。轻轻振荡混匀。若血液小于250μL，用PBS或Buffer ATE调整总体积至250μL。
注意：首选EDTA抗凝血。亦可使用柠檬酸钠抗凝。不建议使用肝素抗凝，残留的肝素会严重抑制下游PCR反应。

2. 加入15 μL Proteinase K溶液，最高速度涡旋混匀5秒。

注意：Proteinase K溶液不能与Buffer BL先混合。

3. 加入250μL Buffer BL至样品中。立即颠倒3-5次混匀，最高速度涡旋混匀15-20秒。后56℃水浴15分钟，其间涡旋混匀2-3次。

注意：涡旋时须让裂解液与血液充分混匀才能保证裂解效果。水浴结束后，简短离心以收集管盖及管壁的水滴。

4. （可选步骤）若需去除RNA，加入10μL RNase A Solution至裂解液中，室温静置 10分钟。

5. 加入250μL无水乙醇至裂解样品中，盖上盖子，快速颠倒3-5次，涡旋混匀30秒。

6. 把DNA结合柱装在2mL收集管中。转移混合液至柱子中，并以10,000×g离心1分钟。

7. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500μL Buffer IRB（请先检查是否已加入无水乙醇）至柱子上并以10,000×g离心1分钟。

8. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500μL Buffer BW（请先检查是否已加入无水乙醇）至柱子中，10,000×g离心1分钟。

9. 重复操作步骤8一次。

10. 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。12,000×g离心空柱2分钟，以甩干柱子的乙醇残留。将吸附柱移入新的1.5 mL离心管，室温开盖晾干5-10 min。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，务必执行晾干步骤，并确保吸附柱中无肉眼可见的残留液体。

11. 向膜中央悬空滴加30-100μL Buffer ATE，室温静置2分钟后以12,000×g离心2分钟收集离心下的基因组DNA。

Buffer ATE在55-60℃预热后加入膜中央洗脱可提高核酸获得率。静置时间有利于大分子基因组DNA释放

12. 弃去柱子，将基因组DNA溶液于-20℃保存（短期可保存2-8℃）或进行下游实验。

【附加方案】处理 0.25-1mL 的血液DNA抽提 (注:该方案需要另外订购 Buffer RBC)

①　转移0.25-1mL抗凝血液样品至2-15mL 离心管中。

②　加入2.5倍体积 Buffer RBC至样品中，颠倒混匀5-10次并静置3分钟。

③　2,000×g离心5分钟。小心倒弃上清液，并反扣于吸水纸上吸尽残液。（注：倒弃上清液时，小心不要倒弃细胞核沉淀。）

④　加入250μL灭菌水和25μL蛋白酶 K溶液到样品中。涡旋30秒打散沉淀团。

⑤　按前述第3步加入Buffer BL开始进行操作。

常见问题

1.  柱子堵塞

 样品裂解不充分: 样品与Buffer BL混匀不充分。重新提取，加入Buffer BL后先颠倒混匀3-5次，然后以最高速度涡旋让样品与Buffer BL充分混匀。

 Proteinase K活性下降: 重新制备Proteinase K。使用后Proteinase K必须保存于-20℃。Proteinase K与Buffer BL不能预先混合。

 样品含凝血块: 处理陈旧的血液样品时，加大蛋白酶的用量，或用附加方案进行提取。

 样品含固体颗粒：在第5步加入乙醇前，10,000×g离心3分钟去除未消化的杂质，转移上清液至新的离心管后再加入乙醇。

 样品用量太多: 白膜层、浓缩血液、细胞悬液中含在大量的细胞，减少样品量。

2.  DNA纯度不达标

 血液样品中存在凝血块: 加大蛋白酶K的用量，消化过程中用移液枪吸打几次打散凝块。或通过离心去除。处理凝血较多的样品时，需用匀浆器充分匀浆凝块。

 样品裂解不充分: 样品与Buffer BL混匀不充分。重新提取加入Buffer BL后延长混匀及涡旋时间

3.  DNA产量低

 血浆或血清等无细胞体液样品，其DNA含量低，通常只有ng级。

 第5步加入乙醇后混匀不充分或乙醇加入的体积不够。

 洗脱不充分: 洗脱液需加到膜中央，可增加洗脱体积或次数。