EK-6005 ProEx细胞膜/细胞质/细胞核蛋白提取试剂盒

【保存条件】

-20℃保存，有效期12个月

【概述】

本试剂盒采用不连续密度梯度离心与分步裂解技术，能够从同一样本中依次高效分离出纯度极高的细胞质（Cytoplasm）、细胞核（Nucleus）及细胞膜（Membrane）组分蛋白。

高纯度分离：配套特制的 Buffer C、N、M 缓冲体系，通过分步离心有效降低各组分间的交叉污染，实验结果背景清晰。

保持蛋白活性：温和的去污剂配方结合低温操作环境，最大限度地保留了蛋白质的生物活性和天然构象。

多组分联提：仅需单次样本制备，即可同步获取三大细胞组分，极大节省了样本量，尤其适用于临床组织或珍稀细胞样本。

兼容性广：提取的各组分蛋白可直接用于 Western Blot、免疫沉淀（IP）、凝胶阻滞实验（EMSA）及各种功能分析。

【操作流程概览】

样本准备 → Buffer C (提取胞质蛋白) → Buffer C (洗涤) → Buffer N (提取核蛋白) → Buffer C (洗涤) → Buffer M (提取膜蛋白)

【操作方法】

一、 样品预处理
贴壁细胞：用预冷PBS洗涤1-2次，使用细胞刮刀刮下或EDTA处理使细胞脱落（避免使用胰酶，防止蛋白降解）。离心收集，弃尽上清。建议细胞量：5-10×10⁶个。

悬浮细胞：预冷PBS洗涤，离心收集，弃尽上清。建议细胞量：5-10×10⁶个。
组织样品：将组织剪碎。按1g组织:2mL预冷Buffer C（含抑制剂）比例加入缓冲液，冰上匀浆至完全均质化（建议≥40mg）。观察到液体变为均匀乳状、无明显块状物后进入下一步。

二、 分步提取步骤
【准备工作】：使用前在Buffer C、N、M中加入蛋白酶抑制剂（如ES-8135）。

1. 提取细胞质蛋白

①　离心收集5-10×10⁶个细胞，加入240μL预冷Buffer C（含抑制剂）。(如：组织用量120mg)

②　涡旋20秒使完全分散（若组织则需完全均质化）。

③　在4°C下孵育混合物10分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。

④　将混合物在4°C下以最高转速或13,000×g转速下离心10分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。

2. 洗涤（去除胞质污染）

①　加入300μL预冷Buffer C，重悬后4°C震荡孵育3-5分钟。

②　4°C,13,000×g转速下离心10分钟，弃上清。

3. 提取细胞核蛋白

①　加入100μL预冷Buffer N（含抑制剂），重悬沉淀。

②　在4°C下孵育混合物10分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。

③　4°C,13,000×g转速下离心10分钟。收集上清液即为细胞核蛋白，转移至新管；沉淀保留。

4. 洗涤（去除胞质污染）

①　加入300μL预冷Buffer C，重悬后4°C震荡孵育3-5分钟。

②　4°C,13,000×g转速下离心10分钟，弃上清。

5. 提取细胞膜蛋白

①　加入100μL预冷Buffer M（含抑制剂），重悬沉淀。

②　在4°C下震荡孵育混合物20分钟，建议增加超声处理：每次10秒，可多次超声以促进膜蛋白溶解。

③　4°C,13,000×g转速下离心10分钟。收集上清液即为细胞膜蛋白，转移至新管。

【注意事项】
1. 比例控制：Buffer C用量不建议降低。若溶液过稠会严重影响组分分离效果。

2. 低温操作：全程需在冰上或 4°C 环境中进行，以保证蛋白稳定性。

3. 样本保存：提取得到的蛋白组分建议立即进行浓度测定（EK-5001 BCA法，本试剂盒兼容BCA），并分装冻存于-80°C。避免反复冻融。

4. 污染控制：洗涤步骤对于减少各组分间的交叉污染至关重要。

5. 高纯度推荐：如需更高纯度膜蛋白，推荐使用EK-6030 ProEx 天然膜蛋白提取试剂盒。

6. 安全防护：仅供科研使用。操作时请佩戴实验服及一次性手套。