Question 1

提取的蛋白如何保存？

Accepted Answer

提取后蛋白短期 4℃（1 天内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份），避免反复冻融（每次冻融损失 5–10% 活性）。全程低温：全程需在冰上或 4℃ 环境中进行，以保证蛋白稳定性。建议提取完成立即用 EK-5001 BCA 法测浓度并分装。

Question 2

与 EK-6010、EK-6100 的区别？

Accepted Answer

EK-6005：胞质 + 核 + 膜 三组分（含 Buffer M 膜蛋白提取）；EK-6010：胞质 + 高纯膜蛋白两组分（不分核），膜蛋白纯度更高、可保留天然构象，适合膜蛋白功能研究；EK-6100：仅 胞质 + 核 两组分（用 CE I/CE II + NE 三种 buffer），不含膜蛋白；EK-6105：仅核蛋白；EK-6115：仅线粒体。选择：三组分一次提取选 6005；高纯度膜蛋白选 6010 或 6030（GPCR 选 6020）；只关注核-质选 6100；只要核蛋白选 6105。

Question 3

可用于哪些下游应用？

Accepted Answer

提取的各组分蛋白可直接用于 Western Blot、免疫沉淀（IP）、凝胶阻滞实验（EMSA）及各种功能分析。扩展：① 转录因子核内活性研究；② 膜受体定量；③ 信号通路核-质转运分析；④ 细胞器功能研究；⑤ 蛋白质组学差异分析。样本保存建议立即进行浓度测定（EK-5001 BCA 法，本试剂盒兼容 BCA），并分装冻存于 -80℃。

Question 4

交叉污染如何降到最低？

Accepted Answer

Buffer C 用量不建议降低。若溶液过稠会严重影响组分分离效果。洗涤步骤对于减少各组分间的交叉污染至关重要。额外建议：① 吸取上清时不触碰沉淀；② 各步严格 4℃；③ 用 WB 内参验证（胞质 GAPDH/Tubulin、核 Lamin B/Histone H3、膜 Na/K-ATPase/Cadherin）；④ 高纯度膜蛋白需求请改用 EK-6030（ProEx 天然膜蛋白）。

Question 5

膜蛋白裂解为何要超声辅助？

Accepted Answer

Buffer M 4℃ 震荡孵育 20 min 时，建议增加超声处理：每次 10 s，可多次超声以促进膜蛋白溶解。原因：膜蛋白与磷脂双分子层结合紧密，单纯去垢剂溶解不彻底；短脉冲超声可机械破坏膜结构帮助释放膜蛋白。注意：超声需冰浴防止温度升高导致蛋白变性；间隔 ≥30 s 避免局部过热。

Question 6

抑制剂是必加的吗？

Accepted Answer

是必加。说明书原文：【准备工作】：使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂（如 ES-8135）。建议同时加 ES-8136（磷酸酶抑制剂）研究磷酸化蛋白；或直接用 ES-8137（蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物 50×）一站式配制。注意：含抑制剂的缓冲液必须现配现用。

Question 7

典型得率？

Accepted Answer

Buffer C / N / M 用量比例：240 µL : 100 µL : 100 µL，对应胞质蛋白量最大、核与膜蛋白量较少（符合细胞内含量分布）。培养细胞 5×10⁶ 通常：胞质 200–500 µg、核 50–200 µg、膜 50–200 µg。组织得率随起始量按比例放大（如组织用量 120 mg 时按比例使用 240 µL Buffer C）。

Question 8

完整的分步流程参数？

Accepted Answer

① 细胞质提取：5–10×10⁶ 细胞 + 240 µL 预冷 Buffer C（含抑制剂），涡旋 20 s 完全分散，4℃ 孵育 10 min（震荡孵育有助于更好裂解），4℃ 13,000×g 离心 10 min，上清=细胞质蛋白；② 洗涤（去胞质污染）：加 300 µL Buffer C 重悬 → 4℃ 震荡 3–5 min → 4℃ 13,000×g 离心 10 min 弃上清；③ 细胞核提取：加 100 µL 预冷 Buffer N（含抑制剂），4℃ 孵育 10 min → 4℃ 13,000×g 离心 10 min，上清=细胞核蛋白，沉淀保留；④ 再次洗涤（同步骤②）；⑤ 细胞膜提取：加 100 µL 预冷 Buffer M（含抑制剂），4℃ 震荡孵育 20 min（建议增加超声处理：每次 10 s，可多次超声以促进膜蛋白溶解），4℃ 13,000×g 离心 10 min，上清=细胞膜蛋白。

Question 9

起始量与适用样品？

Accepted Answer

① 培养细胞 5–10×10⁶ 个（贴壁/悬浮均可）；② 组织 ≥40 mg（按 1 g 组织 : 2 mL 预冷 Buffer C 含抑制剂比例匀浆）。说明书强调：贴壁细胞避免使用胰酶，防止蛋白降解；用 EDTA 处理或刮刀刮下。组织样品：剪碎 → 加 Buffer C 冰上匀浆至完全均质化 → 观察到液体变为均匀乳状、无明显块状物后进入下一步。

Question 10

本试剂盒的核心用途？

Accepted Answer

本试剂盒采用不连续密度梯度离心与分步裂解技术，能够从同一样本中依次高效分离出纯度极高的细胞质（Cytoplasm）、细胞核（Nucleus）及细胞膜（Membrane）三种组分蛋白。配套 Buffer C / N / M 三个特制缓冲液，通过分步离心有效降低各组分间的交叉污染。操作流程概览：样本准备 → Buffer C（提取胞质）→ Buffer C（洗涤）→ Buffer N（提取核）→ Buffer C（洗涤）→ Buffer M（提取膜）。

EK-6005 ProEx细胞膜/细胞质/细胞核蛋白提取试剂盒