产品描述
【保存条件】
4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期12个月
【概述】
本试剂盒采用温和的非变性分步抽提技术，通过细胞溶胀和差速离心，从哺乳动物样本中分离天然结构的细胞膜蛋白和细胞浆蛋白。
分离范围：质膜及各种细胞器膜（线粒体、内质网、高尔基体等）。
优势：保持膜蛋白天然空间结构与活性，实现3-5倍富集。
应用：酶活检测、激酶分析、Native-PAGE、Western Blot（WB）及蛋白质组学研究。
适用样本：贴壁培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。
【使用前准备】
1. 预冷：确保所有缓冲液充分解冻并混匀。试剂A、试剂B和Wash Buffer 在操作过程中必须始终保持在冰上。整个操作过程（离心、匀浆、孵育）必须在4°C或冰上进行。
2. 完全裂解液配制（临用前）：根据实验用量，向试剂A和试剂B中加入蛋白酶抑制剂（如ES-8315）或蛋白酶/磷酸酶抑制剂（如ES-8317）。
3. 1×Wash Buffer工作液配制：取1mL加入20×Wash Buffer 19mL去离子水混匀稀释，配制成1×工作液，冰上备用。
【操作步骤】
I. 培养细胞提取（超始量：5×106-1×107个细胞）
1. 细胞收集：
贴壁细胞：弃培养基，1×Wash Buffer洗涤一次。加入适量Wash Buffer，推荐用细胞刮刀刮下细胞（或用EDTA溶液(0.03%)处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞）。500×g离心5min收集细胞，彻底吸尽上清。注：严禁胰酶消化。
悬浮细胞：500×g离心5 min收集细胞，弃上清。用预冷1×Wash Buffer 洗涤一次，再次离心并彻底吸干上清，留细胞沉淀备用。
2. 细胞质蛋白提取：加入2mL冰冷试剂A（含抑制剂），轻轻吹打重悬，4°C摇晃孵育10min。
3. 收集细胞质蛋白：4°C，16,000×g离心15min。上清液即为细胞质蛋白，转移至新管或-80°C保存。
4. 提取膜蛋白：向沉淀中加入1 mL冰冷试剂B（含抑制剂），彻底吹打均匀，4°C轻柔振荡孵育30min。
5. 膜蛋白收集：4°C，16,000×g离心15min。收集上清液转移至新管，即为细胞膜蛋白。
II. 组织样本提取（起始量：50-80mg新鲜或速冻组织）
1. 组织预处理：切除结缔组织和脂肪等非目标组织，剪成约2mm3碎块。加入2mL 1×Wash Buffer，轻轻颠倒混匀。
2. 洗涤：4°C, 100×g离心2min，弃上清。重复此步骤1-2次，直至洗液澄清，吸净洗液。
注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。
3. 匀浆破碎：加入2mL 冰冷试剂A（含抑制剂），转移至预冷的预冷的匀浆器（最优是玻璃匀浆器或其它匀浆器设备）。
4. 质控鉴定：冰浴匀浆约30-50次。可取2 µL匀浆液显微镜观察：当70-80%的细胞呈现无核周晕环且形态不完整时，停止匀浆。若仍有大量完整细胞，需补加10-30次匀浆。
匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。
5. 提取细胞质蛋白：将匀浆液转至离心管，4°C轻柔摇晃孵育10min。
6. 收集细胞质蛋白：4°C，16,000×g离心15min。上清液即为细胞质蛋白，转移至新管或-80°C保存。
7. 提取膜蛋白：向沉淀中加入1 mL冰冷试剂B（含抑制剂），彻底吹打均匀，4°C轻柔振荡孵育30min。
8. 膜蛋白收集：4°C，16,000×g离心15min。收集上清液转移至新管，即为细胞膜蛋白。
【注意事项】
1. 严禁高温煮样：膜蛋白含有大量疏水区，高温会导致其发生不可逆的聚集。WB实验前，建议加完上样缓冲液后采用温和变性：37°C孵育30-60min或50°C孵育30min。
2. 低温保护：膜蛋白对热敏感，所有离心、匀浆及孵育步骤必须在4°C或冰上进行，否则会导致蛋白弥散。
3. 膜蛋白保存：提取后的膜蛋白建议小量分装。短期（3-5天）使用建议置于4°C保存；如需-80°C长期保存，请务必分装并避免反复冻融，推荐加入5%左右的甘油以增强稳定性。
4. 特殊蛋白说明：对于极难抽提的多重跨膜蛋白（如 GPCR受体），如本试剂盒效果未达预期，建议选用EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。
5. 浓度测定：推荐使用EK-5001 BCA蛋白定量试剂盒。建议先将样本稀释5-10倍后再测定，以排除背景干扰。
6. 安全防护：本试剂盒仅供科研使用。操作时请佩戴实验服及手套。
产品规格
- 货期
- 现货
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-6010、蛋白提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
提取后的膜蛋白建议小量分装
常见问题 (FAQ)
提取的蛋白如何保存？
提取后蛋白：短期（3–5 天）4℃ 保存；如需 -80℃ 长期保存，请务必分装并避免反复冻融，推荐加入 5% 左右的甘油以增强稳定性。浓度测定：推荐使用 EK-5001 BCA 蛋白定量试剂盒，建议先将样本稀释 5–10 倍后再测定以排除背景干扰。
与 EK-6005、EK-6030 的区别？
EK-6005：三组分（胞质+核+膜），膜蛋白纯度中等；EK-6010：仅胞质+膜两组分，膜蛋白纯度更高、3–5 倍富集、保留天然构象；EK-6030：膜蛋白专属试剂盒（Buffer I + Buffer II），与 EK-6010 流程相似但去垢剂配方更优化适合 Native-PAGE / 膜蛋白组学；EK-6020：GPCR 专属（含胶束封装稳定剂）。选择：仅做 WB 用 6010；做 Native-PAGE 或膜蛋白组学用 6030；做 GPCR 功能用 6020。
可用于哪些下游应用？
酶活检测、激酶分析、Native-PAGE、Western Blot（WB）及蛋白质组学研究。扩展：① 膜蛋白受体功能研究；② Co-IP（保留天然构象）；③ 信号通路膜定位分析；④ 拓扑结构分析；⑤ 膜蛋白组学。对极难抽提的多重跨膜蛋白（如 GPCR），建议改用 EK-6020 ProEx GPCR 提取和稳定试剂盒。
膜蛋白严禁高温煮样？
严禁高温煮样：膜蛋白含有大量疏水区，高温会导致其发生不可逆的聚集。WB 实验前，建议加完上样缓冲液后采用温和变性：37℃ 孵育 30–60 min 或 50℃ 孵育 30 min。如果按常规 95–100℃ 5 min 处理，WB 上样孔会出现沉淀或条带涂布状。所有离心、匀浆及孵育步骤必须在 4℃ 或冰上进行。
抑制剂如何添加？
完全裂解液配制（临用前）：根据实验用量，向试剂 A 和试剂 B 中加入蛋白酶抑制剂（如 ES-8135 蛋白酶抑制剂混合物）或蛋白酶/磷酸酶抑制剂（如 ES-8137 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物）。研究磷酸化蛋白时必加 ES-8136 或 ES-8137；研究普通蛋白活性 ES-8135 即可。严禁：含抑制剂的缓冲液长期存放（活性会下降）。
1× Wash Buffer 如何配制？
1× Wash Buffer 工作液配制：取 1 mL 加入 20× Wash Buffer 19 mL 去离子水混匀稀释，配制成 1× 工作液，冰上备用。使用前需充分解冻 + 混匀，操作中始终保持冰上。
组织样品流程的关键？
组织流程独特步骤是冰浴 Dounce 匀浆 + 显微镜质控：① 切除结缔组织和脂肪等非目标组织，剪成约 2 mm³ 碎块；② 2 mL 1× Wash Buffer + 4℃ 100×g 离心 2 min 洗涤 1–2 次至洗液澄清；③ 加 2 mL 冰冷试剂 A（含抑制剂）转入预冷玻璃匀浆器；④ 冰浴匀浆 30–50 次，取 2 µL 显微镜观察：当 70–80% 的细胞呈现无核周晕环且形态不完整时，停止匀浆——若仍有大量完整细胞，需补加 10–30 次匀浆；⑤ 后续与培养细胞流程一致。
完整流程参数（培养细胞）？
① 细胞收集：500×g 离心 5 min，1×Wash Buffer 洗涤 1 次，彻底吸尽上清；② 细胞质蛋白提取：加 2 mL 冰冷试剂 A（含抑制剂），轻轻吹打重悬，4℃ 摇晃孵育 10 min；③ 4℃ 16,000×g 离心 15 min，上清=细胞质蛋白（转新管或 -80℃ 保存）；④ 膜蛋白提取：向沉淀加 1 mL 冰冷试剂 B（含抑制剂），彻底吹打均匀，4℃ 轻柔振荡孵育 30 min；⑤ 4℃ 16,000×g 离心 15 min，上清=细胞膜蛋白。
适用样品与起始量？
① 培养细胞 5×10⁶–1×10⁷（贴壁/悬浮均可）；② 组织 50–80 mg（新鲜或速冻）。关键提示：贴壁细胞严禁胰酶消化，推荐用细胞刮刀刮下（或 EDTA 溶液 0.03% 处理使细胞不再贴壁很紧后吹打）。
本试剂盒的核心特点？
本试剂盒采用温和的非变性分步抽提技术，通过细胞溶胀和差速离心，从哺乳动物样本中分离天然结构的细胞膜蛋白和细胞浆蛋白。分离范围：质膜及各种细胞器膜（线粒体、内质网、高尔基体等）。优势：保持膜蛋白天然空间结构与活性，实现 3–5 倍富集。应用：酶活检测、激酶分析、Native-PAGE、Western Blot 及蛋白质组学研究。
