产品描述
【保存条件】
GPCR蛋白提取及稳定剂保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存一年
【产品概述】
GPCR 属于多次跨膜蛋白，提取后极易因失去磷脂双分子层的支撑而发生构象坍塌或聚集失活。本试剂盒采用尖端的去垢剂胶束（Micelle）封装技术，模拟天然脂质环境，在1-2 小时内高效提取功能性受体。
高稳定性：提取后的受体在4℃可保持功能活性长达1周，-20℃可保存1个月。
应用广泛：特别适用于配体结合实验、激酶活性检测、电生理分析及 Western Blot。
提取量参考：1ml可用于1×106个细胞或50-100 mg组织。
【实验前准备】
配制完全裂解液（现配现用）：根据用量，每1ml GPCR提取液中加入20µL蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（50×），混匀后置于冰上。
【操作方法】
1. 样本收集与洗涤（关键：彻底去除干扰）
A. 培养细胞（贴壁或悬浮细胞）：
① 收集：贴壁细胞推荐用细胞刮刀刮取；悬浮细胞直接收集（4°C, 500 × g离心5分钟）。
② 洗涤：用预冷PBS洗涤细胞2次（收集细胞方法：4°C, 500 × g 离心5分钟）。最终弃净上清，确保细胞沉淀尽量干燥。
B. 组织样本：
洗涤：取 50-100 mg 组织，PBS 洗涤2次去除血污，剪成碎糜状。
2. 裂解与稳定处理
① 加液：每1×106个细胞或50-100 mg组织加入1 mL含抑制剂裂解液。
② 裂解：
细胞：用移液器吹打10-15 次，短暂漩涡混匀。
组织：转移至 Dounce匀浆器，冰浴匀浆 10-15 次。
注：对于 Expi293等过表达系统，增加Dounce匀浆能显著提升活性受体回收率。
③ 孵育：将样本置于 4°C 旋转摇床上孵育30-60分钟。 注：旋转孵育优于静态放置，能确保胶束对膜蛋白的充分封装。
3. 蛋白收集
① 离心：4°C, 16,000 × g 离心20分钟。
② 收集：小心吸取上清液（即为功能性GPCR蛋白），转移至预冷的全新离心管中。
注：立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在4°C下保存长达1周或在-20°C下保存长达 1个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。
【注意事项】
1. 蛋白变性严禁高温：GPCR是膜蛋白，高温（95-100°C）会导致膜蛋白疏水域暴露并发生不可逆聚集，WB 结果通常表现为孔底部有沉淀或条带“涂布状”。推荐方案： 50°C 孵育30分钟，或37°C孵育1小时。
2. 严禁超声破碎：超声产生的局部高温和剪切力会破坏胶束结构，导致受体变性失活。若组织裂解物过于粘稠，请增加匀浆次数或延长孵育时间。
3. 安全防护：为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。
产品规格
- 货期
- 现货
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-6020、蛋白提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存
常见问题 (FAQ)
提取的蛋白如何保存？
提取的受体：立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在 4℃ 下保存长达 1 周或在 -20℃ 下保存长达 1 个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。
与 EK-6010、EK-6030 的选择？
EK-6010：胞质 + 普通膜蛋白，适合 WB 检测多数膜蛋白；EK-6030：天然膜蛋白通用版（不限于 GPCR），适合膜蛋白组学；EK-6020：专属 GPCR，含胶束封装与稳定剂，受体活性保持期最长（4℃ 1 周、-20℃ 1 个月）；适合配体结合等功能实验。选择：研究 GPCR 受体功能 → 6020；常规多次跨膜蛋白 WB → 6010 或 6030 即可。
贴壁与悬浮细胞收集的差异？
① 贴壁细胞：用细胞刮刀刮取（避免胰酶降解 GPCR 胞外区）；② 悬浮细胞：直接 4℃ 500×g 离心 5 min；③ 两者均需预冷 PBS 洗涤 2 次，弃净上清确保细胞沉淀尽量干燥（残留 PBS 会稀释裂解液）；④ 组织：50–100 mg PBS 洗涤 2 次去血污后剪成碎糜状。
可用于哪些下游应用？
配体结合实验、激酶活性检测、电生理分析及 Western Blot。扩展应用：① 配体亲和力测定（Kd / IC50）；② 受体寡聚化研究（CoIP / FRET）；③ 信号通路下游 cAMP / ERK 激酶活性分析；④ 重构脂质体研究；⑤ 共晶体筛选前样品制备。不推荐：传统 SDS-PAGE 高温样品处理流程。
胶束封装技术与传统去垢剂的区别？
传统强力去垢剂（如 SDS、CHAPS）会破坏 GPCR 的磷脂环境导致聚集失活；本试剂盒采用温和去垢剂胶束封装模拟天然脂质双层，将提取出的 GPCR 包裹在胶束内维持其七次跨膜的天然构象。这是配体结合实验、电生理分析能成功的关键——若构象失活，受体无法结合配体。
Expi293 等高表达系统的优化？
对于 Expi293 等过表达系统，增加 Dounce 匀浆能显著提升活性受体回收率。建议：① 增加冰浴 Dounce 匀浆至 20–30 次；② 4℃ 旋转孵育延长至 60 min；③ 必要时加大裂解液体积（每 1×10⁶ 细胞 1.5–2 mL）以提高功能受体回收率。
为什么严禁高温和严禁超声？
蛋白变性严禁高温：GPCR 是膜蛋白，高温（95–100℃）会导致膜蛋白疏水域暴露并发生不可逆聚集，WB 结果通常表现为孔底部有沉淀或条带涂布状。推荐方案：50℃ 孵育 30 min，或 37℃ 孵育 1 小时。严禁超声破碎：超声产生的局部高温和剪切力会破坏胶束结构，导致受体变性失活。若组织裂解物过于粘稠，请增加匀浆次数或延长孵育时间。
完整提取流程？
① 配制完全裂解液（现配现用）：每 1 mL GPCR 提取液 + 20 µL 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（50×），混匀置于冰上；② 样本收集与洗涤：贴壁细胞用刮刀刮取，悬浮细胞 4℃ 500×g 离心 5 min；预冷 PBS 洗涤 2 次（4℃ 500×g 离心 5 min），最终弃净上清；组织：50–100 mg PBS 洗涤 2 次去除血污，剪成碎糜状；③ 裂解：每 1×10⁶ 细胞或 50–100 mg 组织 + 1 mL 含抑制剂裂解液；细胞用移液器吹打 10–15 次 + 短暂涡旋；组织转 Dounce 匀浆器冰浴匀浆 10–15 次；④ 孵育：4℃ 旋转摇床孵育 30–60 min（说明书强调：旋转孵育优于静态放置，能确保胶束对膜蛋白的充分封装）；⑤ 离心：4℃ 16,000×g 离心 20 min；⑥ 收集上清=功能性 GPCR 蛋白，转移至预冷的全新离心管。
起始量与典型应用？
提取量参考：1 mL 可用于 1×10⁶ 个细胞或 50–100 mg 组织。应用：特别适用于配体结合实验、激酶活性检测、电生理分析及 Western Blot。高稳定性：提取后的受体在 4℃ 可保持功能活性长达 1 周，-20℃ 可保存 1 个月。
本试剂盒为什么需要专门设计？
GPCR 属于多次跨膜蛋白，提取后极易因失去磷脂双分子层的支撑而发生构象坍塌或聚集失活。本试剂盒采用尖端的去垢剂胶束（Micelle）封装技术，模拟天然脂质环境，在 1–2 小时内高效提取功能性受体。包装含 GPCR 蛋白提取及稳定剂（EK-6020-1）+ 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物 50×（EK-6020-2）。
