EK-1102 PCR产物纯化试剂盒

产品介绍

本试剂盒采用可高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，适用于从PCR产物、限制性内切酶体系、或其他酶促反应液中回收100bp-10kb的DNA片段，回收率可达90%以上，每个吸附柱每次可吸附的DNA量为20µg。使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。

存储条件

该试剂盒置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，Buffer PB可能产生沉淀，使用前可在37℃水浴中预热10 min至沉淀溶解。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

□ 本试剂盒为无选择性的回收溶液内所有DNA片段，如需回收特定片段，同时去除其他不同大小的片段，请选择琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

□ 回收<100bp或>10kb的DNA片段时，应加大Buffer PB的体积，延长吸附和洗脱时间。

□ 回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低。

□ 高温及潮湿等不利环境因素对吸附柱产生影响，请将吸附柱储存于阴凉干燥的环境中。

开始前试剂准备

□ 按瓶子标签所示，加入4倍体积的无水乙醇稀释Buffer PW，于室温密封保存。

□ 确认Buffer PB溶液显示为黄色。

DNA浓度及纯度检测：

 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。

 OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH₂O比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

操作步骤：

1. 将5倍体积的Buffer PB添加到1倍体积的PCR样品中，然后混匀。

例如，将500µL Buffer PB添加到100µL PCR样品（不包括油的体积），无需去除石蜡油或矿物油。

2. Buffer PB与样品充分混匀后，检查颜色是否为黄色。

如果混合物的颜色为橙色或紫色，则逐滴加入10-30µL 3 M 醋酸钠(pH 5.2)并混合，直到混合物颜色变成黄色。DNA吸附到膜上仅在pH ≤ 7.5时有效。Buffer PB含有一种pH指示剂，在pH ≤7.5时为黄色，在较高pH时为橙色或紫色，可通过颜色轻松确定DNA结合的最佳pH。

3. 将吸附柱套在2mL收集管中，并将上一步得到的溶液加入到吸附柱中，≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

吸附柱最大容量为700µL，若样品体积大于700µL，可分批加入。

4. 向吸附柱中加入500µL Buffer PW（已加入无水乙醇），≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议加入Buffer PW后静置2-5min后再离心。

5. 重复操作步骤4一次。

6. 倒掉收集管中的废液后将吸附柱再次套入收集管中，最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱套入新的1.5mL离心管中并于室温开盖放置5-10min彻底晾干。

注意：Buffer PW中的乙醇残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

7. 向吸附柱膜中央位置悬空滴加30-50µL Buffer EB，盖上盖子室温静置2min后，最大转速 (~13,400×g)离心2min收集DNA溶液并置于-20℃保存。

注意：洗脱体积不应小于30µL，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH₂O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了提高DNA的回收量，若追求更高产量，可用新的 Buffer EB 重复洗脱一次；若追求更高浓度，可将第一次的洗脱液重新加回膜中央再次洗脱。

常见问题：

1. 回收效率低

l Buffer PB加入量不够：正确测量PCR反应液体积，加入足量Buffer PB。

l 洗脱液体积太小：建议用Buffer EB洗脱两次，以获得最高的回收率。洗脱液必须加入柱子的膜中央。洗脱效率取决于洗脱体积和次数。

l 试剂准备有误：Buffer PW没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

2. 下游应用不理想

 盐污染：在加入Buffer PW的步骤中，将Buffer PW加入吸附柱盖上盖子后静置5min再离心。

 纯化的DNA还含有引物二聚体：若引物二聚体污染严重，建议改用EK-1101琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行切胶纯化。

 乙醇污染：洗脱DNA前，打开柱子的盖子，室温晾干5-10min以彻底去除乙醇。若肉眼可见膜上有残留液体，可适当延长干燥时间。

3. A260/230比值低

 这是高盐缓冲液残留的现象。可通过增加一次Buffer PW洗涤并在离心前静置2 min来改善。