产品描述
【保存条件】
4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期12个月
【概述】
ProEx天然膜蛋白提取试剂盒专为从各种哺乳动物样本中高效分离具有天然活性结构的膜蛋白而设计。
核心原理：利用非变性表面活性剂分步抽提，将胞质蛋白与膜蛋白有效分离。
主要特征：实现整体膜和膜相关蛋白3–5倍的丰度富集。
应用场景：特别适用于需要保持蛋白空间构象的功能研究，如酶活性检测、激酶分析、Native-PAGE、ELISA、免疫共沉淀（Co-IP）及膜蛋白组学分析。
【使用前准备】
1. 配制1×Wash Buffer工作液：取1mL加入20×Wash Buffer 19mL去离子水混匀稀释，配制成1×工作液，冰上备用。
2. 完全提取液配置：临用前，根据实验用量向 Buffer I 和 II 中加入蛋白酶抑制剂（如ES-8315）或蛋白酶/磷酸酶抑制剂（如ES-8317）必须现配现用，严禁长期存放已加抑制剂的缓冲液。
3. 低温控制：确保所有步骤均在4°C进行。
【操作步骤】
I. 培养细胞提取（超始量：5×106-1×107个细胞）
1. 细胞收集：
贴壁细胞：弃培养基，1×Wash Buffer洗涤一次。加入适量Wash Buffer，推荐用细胞刮刀刮下细胞（或用EDTA溶液(0.03%)处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞）。500×g离心5min收集细胞，彻底吸尽上清。注：严禁胰酶消化。
悬浮细胞：500×g离心5 min收集细胞，弃上清。用预冷1×Wash Buffer 洗涤一次，再次离心并彻底吸干上清，留细胞沉淀备用。
2. 细胞裂解：加入2mL Buffer I（含抑制剂），轻轻吹打重悬，4°C摇晃孵育10min。
3. 离心：4°C，16,000×g离心15min。上清液即为细胞质蛋白，转移至新管或-80°C保存。
4. 提取膜蛋白：向沉淀中加入1 mL Buffer II（含抑制剂），彻底吹打均匀，4°C轻柔振荡孵育30min。
5. 膜蛋白收集：4°C，16,000×g离心15min。收集上清液转移至新管，即为细胞膜蛋白。
II. 组织样本提取（起始量：50-80mg新鲜或速冻组织）
1. 组织预处理：切除结缔组织和脂肪等非目标组织，剪成约2mm3碎块。加入2mL 1×Wash Buffer，轻轻颠倒混匀。
2. 洗涤：4°C, 100×g离心2min，弃上清。重复此步骤1-2次，直至洗液澄清，吸净洗液。
注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。
3. 匀浆破碎：加入2mL Buffer I（含抑制剂），转移至预冷的预冷的匀浆器（最优是玻璃匀浆器或其它匀浆器设备）。
4. 质控鉴定：冰浴匀浆约30-50次。可取2 µL匀浆液显微镜观察：当70-80%的细胞呈现无核周晕环且形态不完整时，停止匀浆。若仍有大量完整细胞，需补加10-30次匀浆。
匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。
5. 裂解：将匀浆液转至离心管，4°C轻柔摇晃孵育10min。
6. 离心：4°C，16,000×g离心15min。上清液即为细胞质蛋白，转移至新管或-80°C保存。
7. 提取膜蛋白：向沉淀中加入1 mLBuffer II（含抑制剂），彻底吹打均匀，4°C轻柔振荡孵育30min。
8. 膜蛋白收集：4°C，16,000×g离心15min。收集上清液转移至新管，即为细胞膜蛋白。
【注意事项】
1. 严禁高温煮样：膜蛋白含有大量疏水区，高温会导致其发生不可逆的聚集。WB实验前，建议加完上样缓冲液后采用温和变性：37°C孵育30-60min或50°C孵育30min。
2. 低温保护：膜蛋白对热敏感，所有离心、匀浆及孵育步骤必须在4°C或冰上进行，否则会导致蛋白弥散。
3. 膜蛋白保存：提取后的膜蛋白建议小量分装。短期（3-5天）使用建议置于4°C保存；如需-80°C长期保存，请务必分装并避免反复冻融，推荐加入5%左右的甘油以增强稳定性。
4. 特殊蛋白说明：对于极难抽提的多重跨膜蛋白（如 GPCR受体），如本试剂盒效果未达预期，建议选用EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。
5. 浓度测定：推荐使用EK-5001 BCA蛋白定量试剂盒。建议先将样本稀释5-10倍后再测定，以排除背景干扰。
6. 安全防护：本试剂盒仅供科研使用。操作时请佩戴实验服及手套。
产品规格
- 货期
- 现货
- 规格
- 20T、50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-6030、蛋白提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
提取后的膜蛋白建议小量分装
常见问题
该产品如何保存？
请参照产品说明书中的保存条件。一般生物科研试剂建议在2-8℃或-20℃条件下保存，避免反复冻融。具体保存条件请以产品标签为准。
该产品的货期是多久？
ECOTOP SCIENTIFIC常规库存产品一般1-3个工作日内发货。如遇缺货情况，客服会及时与您沟通预计到货时间。
如何获取产品的技术支持？
您可以通过电话（15622108587）或在线客服联系我们的技术支持团队。我们提供产品使用指导、实验方案优化等专业技术服务。
