EK-5012 FFPE组织切片总蛋白提取试剂盒（WB&RPA）

【保存条件】

-20°C 保存，有效期12个月，β-巯基乙醇4°C避光保存，有效期12个月

【概述】

本产品用于从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片中提取总蛋白，下游可用于Western blot和RPA（反相蛋白阵列）实验。该试剂盒优化了提取条件，确保从旧FFPE样本或过度固定的组织中获得高效率的全长完整蛋白，提取效率与冷冻组织相当。适用于临床和研究样本的蛋白质组学分析。

【使用说明】

一、样品前处理

样本质量：组织取样后建议尽快固定（4-10%福尔马林，14-24小时）。固定超过24小时或保存数年的陈旧蜡块蛋白产量可能略有下降。

推荐起始量：2-3个10–15 μm厚、100 mm² 面积切片。蛋白产量因组织类型而异（例如，人结肠~530 μg/5 切片）。

I. 载玻片 FFPE 前处理（适用于安装在显微镜载玻片上的切片）

1. 二甲苯脱蜡：将载玻片完全浸没于二甲苯中，室温孵育10 min。重复此步骤2次（共3次）。

2. 梯度乙醇复水：依次在100%乙醇、96%乙醇、70%乙醇中各孵育10 min。每种浓度均需重复操作一次。

3. 收集：浸入双蒸水中 30 s，敲干余水。用针刮取感兴趣区域组织，转移至1.5mL离心管中，立即提取。

II. FFPE 石蜡块前处理（适用于直接从 FFPE 样本块切割的切片）

1. 二甲苯脱蜡：向含切片的管中加入1mL二甲苯，剧烈涡旋10 s，孵育10 min。14,000×g离心2 min，弃上清。重复2次（共3次）。

2. 梯度乙醇复水：依次在100%乙醇、96%乙醇、70%乙醇中各孵育10 min。14,000×g离心2 min，弃上清。重复2次（共3次）。每种浓度均需重复操作一次。

3. 收集：最后一次离心后，尽可能吸干残留液体，注意勿扰动松散的组织沉淀 。

二、总蛋白提取（核心步骤）

1. 配制工作液：每94 μL Buffer EXB加入6 μL β-巯基乙醇（现用现配）。

2. 裂解：向含组织沉淀的管中加入100μL工作液，涡旋混合。（在通风橱中进行）

3. 冰浴预冷：在冰上孵育15min，然后涡旋混合，期间间歇涡旋。

4. 高温脱交联：使用封口膜或密封夹加固管盖并置于100°C孵育20min。
注意：务必使用封口膜或密封夹加固管盖，防止高温孵育时爆裂。

5. 持续修复：转移至恒温震荡器，在80°C条件下以750 rpm震荡孵育2小时。

6. 冷却与收集：

①　孵育结束，取出后立即置于4°C 环境（或冰上）静置1min以平衡压力。

②　移除封口膜或密封夹在 4°C下以 14,000 ×g离心15min。

③　小心收集上清液（即提取的总蛋白）至新管中。

7. 蛋白定量：提取液含高浓度去垢剂和还原剂，严禁使用常规BCA法。建议使用商业试剂盒（如 EK-5004 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）。稀释上清液1:3-1:100，进行管式或微板测定。

【注意事项】

1. 起始材料质量影响产量：固定时间过长（>24 小时）或储存不当会降低效率或条带弥散。

2. 低产量故障排除：检查起始材料量、脱石蜡彻底性；如样本含过多石蜡，用手术刀移除。

3. 蛋白定量：确保使用兼容还原剂的蛋白测定试剂盒进行蛋白定量。

4. 结晶析出：Buffer EXB低温下可能析出为正常现象，使用时37°C复温即可溶解。

5. 安全防护：为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

6. 科研用途：该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。