EK-1005 FastPure 彩色去内毒素质粒小量提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒采用彩色溶液配方，提取步骤更清晰可视。同时应用先进的硅胶膜吸附技术，操作简单、快速。菌体经碱裂解法处理后通过离心吸附柱，专一性结合DNA，洗去杂质，高效快速提取多至40μg的质粒DNA。本试剂盒使用独特缓冲液配方，最大限度去除蛋白杂质、内毒素及其它有机化合物，每次可处理1-5mL菌液。得到的DNA比传统试剂盒纯度更高，可直接用于转染、酶切、转化、测序及PCR 等分子生物学实验。

存储条件

RNase A Solution收到后请冻于-20°C，加至Buffer P1后混合液保存于4°C。除RNase A Solution外，其余组分在室温（15-25°C）密封、避光干燥保存至少12个月。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL/2mL离心管

开始前注意事项

 Buffer P1为粉红色澄清溶液，Buffer P2为紫红色澄清溶液，Buffer N3为黄色澄清溶液。

 Buffer P2和N3如有混浊现象，可在37℃水浴中加热5-10min即可恢复澄清。

 处理低拷贝质粒时，按比例扩大Buffer P1、Buffer P2和Buffer N3的用量，可处理5~10mL细菌培养液。

 质粒提取所有步骤都在室温（15-25°C）下进行。

 试剂颜色不会影响到质粒提取的浓度及纯度，请放心使用。

开始前试剂准备

□ 短暂离心RNase A Solution管，把全部RNase A Solution转移至Buffer P1中，并于2-8℃保存。

□ 按瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇稀释Buffer PW，于室温密封保存。

DNA浓度及纯度检测：

 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。

OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH₂O比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

操作步骤：

1. 将含质粒的菌种接种（1:500-1:1000接种）于含1~5mL LB-抗生素培养液的10-20mL培养管中，37℃摇床培养12~16h。

2. 将菌液加入离心管中，使用常规台式离心机，≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3. 倒弃培养基，在吸水纸轻轻拍打吸尽残液（或用吸头吸尽）。加入250µL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），高速涡旋（或吸头吹打）重悬细菌至无菌块。

加完Buffer P1后溶液为粉红色，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4. 往离心管中加入250µL Buffer P2，温和颠倒混匀8~10次。

不要涡旋！轻轻颠倒混匀即可，涡旋会引起细菌基因组DNA污染。溶液变得粘稠而透亮表明细菌已充分裂解。如有必要，可室温放置2min，这一步操作时间不要超过5min以免质粒受到破坏。此时溶液应变为紫色。

5. 向离心管中加入350µL Buffer N3，立即温和地上下翻转8~10次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。最大转速(~13,400×g )离心10min。

不要涡旋！加入 Buffer N3 后立即温和翻转，观察到溶液由紫色转变为均匀黄色，并伴随大量白色絮状沉淀，即表示中和完全。

注意：如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6. 将上一步收集的上清液用移液器吸入到吸附柱中，注意尽量不要吸到沉淀。≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

这一步须室温离心，低温离心会引起SDS析出而无法获得澄清的上清液。吸附柱单次上柱最大容量为700µL，请勿超过吸附柱单次上柱最大容量，可分批多次离心。

7. 向吸附柱中加入500µL去内毒素液Buffer EF，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

8. （选做）重复操作步骤7

重复一次Buffer EF清洗吸附柱可以更好去除内毒素及其它蛋白质的影响。

9. 向吸附柱中加入500µL漂洗液Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

10. 重复操作步骤9一次。

11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，

12. 将吸附柱转移至新的无菌1.5 mL离心管中，开盖室温静置5-10 min以彻底去除残留乙醇。后加入30-60µL Buffer EB（或无菌ddH₂O）至柱子的膜中央并盖上盖子静置1-2min，最大转速(~13,400×g)离心2min以洗脱DNA至离心管。

柱子最低的洗脱体积为30µL，低于30µL会导致洗脱效率下降。30µL可洗脱60-70%的质粒DNA，50µL可洗脱出80-85%的质粒DNA。若需要获得最高产量，可重复操作本步骤进行第二次洗脱。Buffer EB在55-60℃预热后加入膜中央洗脱也可提高质粒获得率。

13. 弃去柱子，将质粒DNA溶液于-20℃保存或进行下游实验。

常见问题：

1. 质粒DNA产量低

 细胞未充分裂解：细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。

 试剂准备有误：Buffer P2若有沉淀析出需加热溶解。Buffer PW需加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

 质粒拷贝数：载体应拷贝数差异会造成质粒产量明显波动。高产量载体常有2~3倍的产量波动。长片段质粒（>7kb）和表达型载体常为中低拷贝数质粒，每毫升菌液的产量约为0.5~2µg，需加大菌液量提取。

 菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好划线活化以稳定产量。

2.基因组污染

 培养时间过长：培养时间应控制到12~16个小时。

 裂解问题：加入Buffer P2后应该轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，加入Buffer P2时算起，总时间不要超过5min。