产品描述
产品介绍
本试剂盒采用彩色溶液配方，提取步骤更清晰可视。同时应用先进的硅胶膜吸附技术，操作简单、快速。菌体经碱裂解法处理后通过离心吸附柱，专一性结合DNA，洗去杂质，高效快速提取多至40μg的质粒DNA。本试剂盒使用独特缓冲液配方，最大限度去除蛋白杂质、内毒素及其它有机化合物，每次可处理1-5mL菌液。得到的DNA比传统试剂盒纯度更高，可直接用于转染、酶切、转化、测序及PCR 等分子生物学实验。
存储条件
RNase A Solution收到后请冻于-20°C，加至Buffer P1后混合液保存于4°C。除RNase A Solution外，其余组分在室温（15-25°C）密封、避光干燥保存至少12个月。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL/2mL离心管
开始前注意事项
Buffer P1为粉红色澄清溶液，Buffer P2为紫红色澄清溶液，Buffer N3为黄色澄清溶液。
Buffer P2和N3如有混浊现象，可在37℃水浴中加热5-10min即可恢复澄清。
处理低拷贝质粒时，按比例扩大Buffer P1、Buffer P2和Buffer N3的用量，可处理5~10mL细菌培养液。
质粒提取所有步骤都在室温（15-25°C）下进行。
试剂颜色不会影响到质粒提取的浓度及纯度，请放心使用。
开始前试剂准备
□ 短暂离心RNase A Solution管，把全部RNase A Solution转移至Buffer P1中，并于2-8℃保存。
□ 按瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇稀释Buffer PW，于室温密封保存。
DNA浓度及纯度检测：
回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
操作步骤：
1. 将含质粒的菌种接种（1:500-1:1000接种）于含1~5mL LB-抗生素培养液的10-20mL培养管中，37℃摇床培养12~16h。
2. 将菌液加入离心管中，使用常规台式离心机，≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
3. 倒弃培养基，在吸水纸轻轻拍打吸尽残液（或用吸头吸尽）。加入250µL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），高速涡旋（或吸头吹打）重悬细菌至无菌块。
加完Buffer P1后溶液为粉红色，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4. 往离心管中加入250µL Buffer P2，温和颠倒混匀8~10次。
不要涡旋！轻轻颠倒混匀即可，涡旋会引起细菌基因组DNA污染。溶液变得粘稠而透亮表明细菌已充分裂解。如有必要，可室温放置2min，这一步操作时间不要超过5min以免质粒受到破坏。此时溶液应变为紫色。
5. 向离心管中加入350µL Buffer N3，立即温和地上下翻转8~10次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。最大转速(~13,400×g )离心10min。
不要涡旋！加入 Buffer N3 后立即温和翻转，观察到溶液由紫色转变为均匀黄色，并伴随大量白色絮状沉淀，即表示中和完全。
注意：如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6. 将上一步收集的上清液用移液器吸入到吸附柱中，注意尽量不要吸到沉淀。≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
这一步须室温离心，低温离心会引起SDS析出而无法获得澄清的上清液。吸附柱单次上柱最大容量为700µL，请勿超过吸附柱单次上柱最大容量，可分批多次离心。
7. 向吸附柱中加入500µL去内毒素液Buffer EF，≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
8. （选做）重复操作步骤7
重复一次Buffer EF清洗吸附柱可以更好去除内毒素及其它蛋白质的影响。
9. 向吸附柱中加入500µL漂洗液Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
10. 重复操作步骤9一次。
11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，
12. 将吸附柱转移至新的无菌1.5 mL离心管中，开盖室温静置5-10 min以彻底去除残留乙醇。后加入30-60µL Buffer EB（或无菌ddH2O）至柱子的膜中央并盖上盖子静置1-2min，最大转速(~13,400×g)离心2min以洗脱DNA至离心管。
柱子最低的洗脱体积为30µL，低于30µL会导致洗脱效率下降。30µL可洗脱60-70%的质粒DNA，50µL可洗脱出80-85%的质粒DNA。若需要获得最高产量，可重复操作本步骤进行第二次洗脱。Buffer EB在55-60℃预热后加入膜中央洗脱也可提高质粒获得率。
13. 弃去柱子，将质粒DNA溶液于-20℃保存或进行下游实验。
常见问题：
1. 质粒DNA产量低
细胞未充分裂解：细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。
试剂准备有误：Buffer P2若有沉淀析出需加热溶解。Buffer PW需加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。
质粒拷贝数：载体应拷贝数差异会造成质粒产量明显波动。高产量载体常有2~3倍的产量波动。长片段质粒（>7kb）和表达型载体常为中低拷贝数质粒，每毫升菌液的产量约为0.5~2µg，需加大菌液量提取。
菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好划线活化以稳定产量。
2.基因组污染
培养时间过长：培养时间应控制到12~16个小时。
裂解问题：加入Buffer P2后应该轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，加入Buffer P2时算起，总时间不要超过5min。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1005、质粒提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
-20°C，加至Buffer P1后混合液保存
常见问题 (FAQ)
提取后的质粒应如何储存才能保持低内毒素？
短期：4℃ 储存（1 周内）；长期：分装后 -20℃ 储存，避免反复冻融。储存容器建议使用低内毒素级别离心管，储存缓冲液优选试剂盒提供的 Buffer EB；避免使用未灭菌的水或反复使用同一移液器吸头取样，以防外源 LPS 引入。RNase A Solution 收到后请 -20℃ 冻存，加入 Buffer P1 后混合液 2–8℃ 保存。
低得率的常见原因有哪些？
常见原因：① 细菌未充分裂解——加入 Buffer P1 后必须涡旋或吹打至无菌块（成团菌体无法裂解）；② 试剂准备失误——Buffer P2/N3 出现混浊时需 37℃ 水浴 5–10 min 至澄清，Buffer PW 必须用 4 倍体积无水乙醇稀释（最终乙醇浓度约 80%）；③ 质粒拷贝数低——长片段（>7 kb）或表达型载体每毫升菌液仅 0.5–2 µg，需加大菌液量；④ 洗脱体积过小——Buffer EB 最低 30 µL（30 µL 仅洗 60–70%、50 µL 洗 80–85%）；⑤ 菌种保存中质粒丢失——使用前划线活化。
提取流程中需要特别注意哪些操作以保证去内毒素效果？
关键点：① Buffer EF 漂洗推荐执行两次（每次 500 µL，≥8000×g 离心 30 s）；② 所有操作戴手套，避免外源 LPS 污染；③ Buffer PW 必须按瓶身指示加入无水乙醇稀释；④ 干燥吸附柱步骤的最大转速 ~13,400×g 离心 2 min 后，需将吸附柱开盖室温静置 5–10 min 彻底去除残留乙醇，避免影响转染；⑤ 用 30–60 µL Buffer EB 洗脱（最低不少于 30 µL，否则得率下降）；⑥ 长期储存使用低内毒素离心管。
如何判断提取的质粒是否真的是低内毒素？
可使用 LAL（Limulus Amebocyte Lysate）凝胶法或动力学比浊法检测内毒素水平。简易判断方法是：将该质粒转染敏感细胞（如原代神经元）后观察 24h 细胞活力；若细胞状态良好、转染效率符合预期，间接说明内毒素已被有效去除。本试剂盒推荐执行 Buffer EF 漂洗两次以获得最佳去内毒素效果。
提取后的质粒 DNA 中 supercoiled（超螺旋）形式比例大约是多少？
经标准操作流程提取的质粒以超螺旋形式（CCC）为主，琼脂糖凝胶电泳可见单一明亮主带，同时可能伴有少量开环（OC）和线性（L）形式。超螺旋比例越高，转染与酶切效率越好。本试剂盒每次最高可提取 40 μg 质粒 DNA。
适合哪些下游应用？
适合所有对内毒素敏感的应用，包括：原代细胞与干细胞的瞬时转染、慢病毒/AAV 病毒包装的质粒共转染、CRISPR 基因编辑的 sgRNA/Cas9 共转染、动物体内核酸注射（包括尾静脉注射、肌注）、小鼠胚胎注射等；同时也兼容所有常规分子生物学实验（酶切、PCR、测序、连接、转化）。
去内毒素小提（EK-1005）与普通小提（EK-1001）的核心区别是什么？
EK-1005 在裂解-中和-上柱后增加了一道 Buffer EF 去内毒素液漂洗步骤（用量 60 mL/50T，即每柱 500 µL，可选重复一次），该缓冲液专门用于将硅胶膜上结合的脂多糖（LPS）洗脱掉；其余步骤（P1/P2/N3 用量、PW 漂洗、EB 洗脱）与 EK-1001 完全一致。EK-1001 不含 Buffer EF，不适合内毒素敏感的下游应用。
内毒素水平多高会显著影响转染效率？
已发表研究显示，对大多数常用细胞系，内毒素水平需达到 ≥2000 EU/μg DNA 才会显著抑制转染；对 Huh-7 等高敏感细胞，更低剂量也会有影响。本试剂盒通过 Buffer EF 漂洗（推荐执行两次以获得最佳效果）可将内毒素降至适用于敏感细胞转染的水平，远低于影响转染的阈值。
质粒小提后哪些因素会影响 OD260/OD280 比值？
本试剂盒提取的质粒，OD260/OD280 理想值为 1.7–2.0。蛋白质或苯酚残留污染会显著降低比值。要点：① 严格按说明书加 Buffer P1（250 µL）/P2（250 µL）/N3（350 µL）；② Buffer PW 第一次使用前需加入 4 倍体积无水乙醇稀释；③ Buffer EF 是去内毒素的关键步骤，不要漏做；④ 使用 Buffer EB 洗脱可获得更准确的 260/280 比值，使用 ddH₂O 洗脱则因 pH 不稳定会使比值偏低。
使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可以用于哺乳动物细胞转染吗？
可以。本试剂盒在常规质粒小提流程基础上增加了 Buffer EF 去内毒素液漂洗步骤（500 µL Buffer EF 上柱离心 30 s，可选重复一次以获得更彻底的去内毒素效果），最大限度去除蛋白杂质、内毒素和其他有机化合物，提取的质粒 DNA 适用于敏感细胞（HEK293T、原代细胞、干细胞等）的转染、AAV/慢病毒包装质粒共转染以及小鼠体内核酸注射等应用。
