EK-6055 IP/Co-IP蛋白互作试剂盒（琼脂糖法）

产品介绍

本品采用 Protein A/G PLUS 琼脂糖珠作为免疫沉淀载体，具有广泛的抗体结合谱，适用于小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，大鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c，人 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，以及兔、山羊来源的多克隆抗体。经优化的缓冲液体系可有效维持抗体与抗原的高亲和力结合，并保障蛋白质复合体（Co-IP）的完整性与稳定性，从而获得高质量的免疫沉淀结果。

存储条件

于 4°C 下避光密封保存，有效期为12个月。注意：严禁冷冻储存，冻融会导致琼脂糖珠三维网状结构不可逆损坏，造成结合性能下降。

需要额外准备的材料

□ PBS缓冲液

□ 无菌1.5mL离心管

□ 台式离心机

实验前准备：

1. 缓冲液配制：IP裂解结合缓冲液与IP洗涤缓冲液在使用前，须按1:100比例补加蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Cocktail），混匀后即配即用，全程置于冰上操作，以防止蛋白酶降解目的蛋白。

2. 预冷器具：实验开始前，提前将离心机、金属浴/冰盒、离心管及PBS冷却至4°C备用。

操作步骤：

1. 总蛋白提取

(1) 动物细胞样本: 

①　细胞收集：收集1×10×10⁷~2×10⁷个细胞，用预冷PBS清洗2~3次（4°C，1000 g，离心5 min收集细胞沉淀），以彻底去除残余培养基成分；

②　裂解：加入500 μL含抑制剂的IP裂解结合缓冲液。

③　充分破碎：首选冰上超声破碎（建议参数：功率20%，3 s ON/5 s OFF，循环5~10次）直至裂解液澄清；若无超声设备，可在冰上裂解30 min，期间每10 min 进行剧烈涡旋或反复吹打混匀。

④　离心收集：4℃ 12000×g离心5-10 min，收集上清至新的离心管中；

(2) 组织样本

①　清洗：新鲜或冻存组织均需用预冷PBS充分洗净表面血迹及杂质。

②　破碎（二选一）：

A. (液氮研磨)：取0.1~0.2g干净的组织，用液氮在研钵中充分研磨，转移粉末至预冷的新离心管中；

B. (匀浆仪破碎)：取0.1~0.2g干净的组织，加入300~500 μL预冷的IP裂解结合缓冲液（含抑制剂），匀浆破碎（下一步则无需再加裂解液，直接进行步骤④），根据不同匀浆设备进行如下操作；

珠打式匀浆仪：5.0-6.0 m/s，运行 30s，冰上冷却 2 min，重复 2-3 次。

剪切式匀浆仪：8000-10000 rpm，每次 10s，重复 2-3 次，严禁产生气泡。

③　裂解：将样本管置于冰上，每组加入300~500 μL预冷的IP裂解结合缓冲液（含抑制剂），吹打混匀；

④　超声辅助裂解：若裂解液中仍可见明显颗粒，可于冰上超声（5 s ON/5 s OFF，循环3次）直至溶液基本澄清。如无超声设备，可置于冰上静置裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5~10 s；

⑤　离心收集：4℃ 12000×g离心10 min，收集上清至新的离心管中；

注：取30~50 μL上清作为 Input 对照，余下裂解液用于后续 IP 实验。

2. 非特异性蛋白预处理（强烈推荐，可选做）

①　取上述裂解液，加入10 μL杂蛋白去除琼脂糖（Clean Agarose），充分混匀。

②　4°C缓慢旋转孵育30~60 min，使非特异性蛋白充分吸附至琼脂糖珠上。

③　4°C，1000×g离心5 min，将上清液小心转移至新管，即为预处理后的裂解液，用于后续实验。

3. 抗原-抗体-琼脂糖珠结合

①　抗体孵育：将1 mL蛋白上清（含总蛋白量约100~500 μg）转移至1.5 mL微量离心管中，加入1~10 μL（即0.2~2 μg）目标抗体（具体用量可参考抗体说明书），于4°C旋转孵育1小时至过夜，使抗体与目标蛋白充分结合。

②　珠子捕获：加入15~20 μL悬浮体积的Protein A/G-Plus 琼脂糖珠（使用前颠倒充分混匀），盖紧管盖，置于摇杆平台或旋转混匀仪上于4°C孵育1小时至过夜，使珠子充分捕获抗体-抗原复合物。

③　收集复合物：4°C，1000×g离心5 min，收集免疫沉淀复合物（琼脂糖珠沉淀）。小心吸除并丢弃上清液，避免扰动珠子。

④　洗涤：向离心管中加入500 μL含蛋白酶抑制剂的IP裂解结合缓冲液，轻柔颠倒混匀30次使琼脂糖珠充分分散，于4°C以1,000×g离心5 min后弃上清。重复上述洗涤操作3~4次，末次洗涤后用移液器尽量吸净残余液体，以降低背景干扰。

4. 洗脱

本说明书提供以下两种洗脱方案，操作者可根据后续检测方法的需要选择适合的洗脱方式。

①　SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法（变性洗脱法）：向琼脂糖珠中加入50 μL变性洗脱缓冲液，充分混匀后于95°C加热5~10 min使蛋白变性解离；12,000×g离心2~5 min，将上清液转移至新的离心管中即为洗脱产物。该产物已含SDS上样缓冲液成分，可直接用于SDS-PAGE或Western Blot检测，无需额外添加蛋白上样缓冲液；如需进行质谱分析，可在电泳后切取目的胶条送检。

②　非变性洗脱法：向琼脂糖珠中加入50 μL非变性洗脱缓冲液，涡旋振荡20 s后于4°C振荡孵育10~15 min；再次涡旋振荡20 s，以1,000×g离心20 s后静置1 min，将上清液小心转移至新的离心管中，于-80°C长期保存。该洗脱产物保留蛋白的天然构象及生物活性，适用于后续质谱、SDS-PAGE、Western Blot及功能活性检测等多种下游分析。

注：若选择非变性洗脱法，建议暂时保留洗脱后的琼脂糖珠。当非变性洗脱效率不理想时，可进一步采用变性洗脱法（SDS-PAGE上样缓冲液）对残余结合蛋白进行二次洗脱回收。

注意事项：

1. 温控：实验全程须在冰上或4°C低温环境中操作，以抑制蛋白酶活性，防止目的蛋白降解及蛋白质复合体解离。

2. 转速：琼脂糖珠结构脆弱，所有涉及珠子的离心步骤，离心力均不得超过1,000××g，超速离心易导致琼脂糖珠物理破碎，产生细小碎片干扰后续检测结果。

3. 洗涤：末次洗涤结束后，须用移液器尽量吸净管底残余液体，避免残留缓冲液稀释洗脱产物，影响后续检测的灵敏度。