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【保存条件】
4℃保存3个月，-20℃保存12个月
【概述】
线粒体是细胞代谢的核心。本试剂盒采用成熟的去污剂裂解法，可在不使用超速离心的情况下，从培养细胞或硬/软组织中快速富集线粒体。 双方案支持： 兼容 Dounce 匀浆法（试剂 C 稀释液） 和 试剂裂解法。 高完整性： 维持线粒体外膜完整，适用于下游呼吸链活性、膜电位（JC-1）及蛋白分析。 纯度优化： 提供差速离心参数，可根据需求降低溶酶体和过氧化物酶体污染。
【使用建议（仅供参考）】
选项A：动物细胞分离线粒体
1. 使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂A和试剂C中;仅将抑制剂添加到用于实验的试剂量中，而不是添加到储备溶液中。
2. 在2.0mL微量离心管中以~850×g离心2分钟收获沉淀2×107个细胞，小心地取出并丢弃上清液。
3. 加入800μL线粒体分离试剂A，以中速涡旋5秒，并将试管在冰上孵育2分钟。
注意：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性。
4. 加入10μL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋5秒。
5. 将试管在冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。
6. 加入800μL线粒体分离试剂C倒置试管数次混合（不要涡旋）。
7. 将离心管在4°C下以700×g离心管离心10分钟。
8. 将上清液转移到新的2.0 mL离心管中，并在4°C下以12,000×g离心15分钟。
注意：如需获得更纯的线粒体部分，减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以3000×g离心15分钟。
9. 将上清液（胞质部分）转移到新管中，沉淀含有分离的线粒体。
10. 向沉淀中加入500μL线粒体分离试剂C，然后以12,000×g离心5分钟，弃去上清液，沉淀即为纯化后得到的线粒体。
11. 在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。
选项B：50-200mg动物组织分离线粒体
1. 使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂A和试剂C中;仅将抑制剂添加到用于实验的试剂量中，而不是添加到储备溶液中。
洗涤缓冲液配制：将试剂C与纯水1:1混合摇匀即可（如需1ml 洗涤缓冲液，则取0.5ml试剂C加入0.5ml纯水瀑匀即可）。
2. 取50-200mg组织在PBS溶液中切碎，使用匀浆机中破碎以破碎组织关联，应减少细胞破裂。
注意：如组织较硬如心脏组织，可50-200毫克的硬组织（心脏）在含有0.3毫克/毫升胰蛋白酶的PBS溶液中切成小块，并在冰上孵化三分钟。孵育后，样品在4°C的温度下以700×g离心一分钟。然后仔细丢弃上清液，并收集组织颗粒。添加800微升含有4毫克/毫升BSA的PBS溶液，并使用Polytron或Dounce均质器研磨组织样品，以破坏组织关联。
3. 组织匀质物在4°C下以1000×g离心3分钟，小心地取出并丢弃上清液。
4. 加入800μL线粒体分离试剂A（加入适量BSA粉末至终浓度为4mg/ml），以中速涡旋5秒，并将试管在冰上孵育2分钟。
注意：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性。
5. 加入10μL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋5秒。
6. 将试管在冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。
7. 加入800μL线粒体分离试剂C倒置试管数次混合（不要涡旋）。
8. 将离心管在4°C下以700×g离心管离心10分钟。
9. 将上清液转移到新的2.0 mL离心管中，并在4°C下以12,000×g离心15分钟。
注意：如需获得更纯的线粒体部分，减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以3000×g离心15分钟。
10. 将上清液（胞质部分）转移到新管中，沉淀含有分离的线粒体。
11. 向沉淀中加入500μL洗涤缓冲液重悬沉淀，然后以12,000×g离心5分钟，弃去上清液，沉淀即为纯化后得到的线粒体。
注意：洗涤缓冲液配制参考步骤1中。
12. 在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。
【注意事项】
1. 尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
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