产品描述
【保存条件】
4℃保存3个月，-20℃保存12个月
【概述】
线粒体是细胞代谢的核心。本试剂盒采用成熟的去污剂裂解法，可在不使用超速离心的情况下，从培养细胞或硬/软组织中快速富集线粒体。 双方案支持： 兼容 Dounce 匀浆法（试剂 C 稀释液） 和 试剂裂解法。 高完整性： 维持线粒体外膜完整，适用于下游呼吸链活性、膜电位（JC-1）及蛋白分析。 纯度优化： 提供差速离心参数，可根据需求降低溶酶体和过氧化物酶体污染。
【使用建议（仅供参考）】
选项A：动物细胞分离线粒体
1. 使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂A和试剂C中;仅将抑制剂添加到用于实验的试剂量中，而不是添加到储备溶液中。
2. 在2.0mL微量离心管中以~850×g离心2分钟收获沉淀2×107个细胞，小心地取出并丢弃上清液。
3. 加入800μL线粒体分离试剂A，以中速涡旋5秒，并将试管在冰上孵育2分钟。
注意：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性。
4. 加入10μL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋5秒。
5. 将试管在冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。
6. 加入800μL线粒体分离试剂C倒置试管数次混合（不要涡旋）。
7. 将离心管在4°C下以700×g离心管离心10分钟。
8. 将上清液转移到新的2.0 mL离心管中，并在4°C下以12,000×g离心15分钟。
注意：如需获得更纯的线粒体部分，减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以3000×g离心15分钟。
9. 将上清液（胞质部分）转移到新管中，沉淀含有分离的线粒体。
10. 向沉淀中加入500μL线粒体分离试剂C，然后以12,000×g离心5分钟，弃去上清液，沉淀即为纯化后得到的线粒体。
11. 在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。
选项B：50-200mg动物组织分离线粒体
1. 使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂A和试剂C中;仅将抑制剂添加到用于实验的试剂量中，而不是添加到储备溶液中。
洗涤缓冲液配制：将试剂C与纯水1:1混合摇匀即可（如需1ml 洗涤缓冲液，则取0.5ml试剂C加入0.5ml纯水瀑匀即可）。
2. 取50-200mg组织在PBS溶液中切碎，使用匀浆机中破碎以破碎组织关联，应减少细胞破裂。
注意：如组织较硬如心脏组织，可50-200毫克的硬组织（心脏）在含有0.3毫克/毫升胰蛋白酶的PBS溶液中切成小块，并在冰上孵化三分钟。孵育后，样品在4°C的温度下以700×g离心一分钟。然后仔细丢弃上清液，并收集组织颗粒。添加800微升含有4毫克/毫升BSA的PBS溶液，并使用Polytron或Dounce均质器研磨组织样品，以破坏组织关联。
3. 组织匀质物在4°C下以1000×g离心3分钟，小心地取出并丢弃上清液。
4. 加入800μL线粒体分离试剂A（加入适量BSA粉末至终浓度为4mg/ml），以中速涡旋5秒，并将试管在冰上孵育2分钟。
注意：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性。
5. 加入10μL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋5秒。
6. 将试管在冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。
7. 加入800μL线粒体分离试剂C倒置试管数次混合（不要涡旋）。
8. 将离心管在4°C下以700×g离心管离心10分钟。
9. 将上清液转移到新的2.0 mL离心管中，并在4°C下以12,000×g离心15分钟。
注意：如需获得更纯的线粒体部分，减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以3000×g离心15分钟。
10. 将上清液（胞质部分）转移到新管中，沉淀含有分离的线粒体。
11. 向沉淀中加入500μL洗涤缓冲液重悬沉淀，然后以12,000×g离心5分钟，弃去上清液，沉淀即为纯化后得到的线粒体。
注意：洗涤缓冲液配制参考步骤1中。
12. 在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。
【注意事项】
1. 尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
产品规格
- 货期
- 现货
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-6115、线粒体分离、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
4℃保存3个月，-20℃保存
常见问题 (FAQ)
提取的线粒体如何保存？
提取的线粒体： -80℃保存。在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。最佳实践：当天提取当天检测；冷冻保存仅适合做总蛋白 WB / MS 等不需要膜完整性的应用尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。
为什么冻融可能损害线粒体完整性？
在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。原因：冻融形成的冰晶会刺破线粒体外膜，导致：① 内膜内容物（细胞色素 c 等）泄漏；② 呼吸链活性下降；③ 膜电位测定假阴性。建议：当天分离当天检测；如必须保存，可加 5–10% 甘油或 trehalose 冷冻保护剂分装 -80℃。
可用于哪些下游应用？
呼吸链活性、膜电位（JC-1）及蛋白分析。扩展应用：① 线粒体蛋白 WB（COX IV、VDAC、SDHA 等内参）；② 线粒体动力学研究（融合-分裂相关蛋白）；③ 凋亡研究（细胞色素 c 释放）；④ 线粒体氧化磷酸化复合物分析；⑤ Mito-DNA 提取（先提线粒体再提 DNA）；⑥ 线粒体钙离子动力学。
高纯度提取的优化？
如需获得更纯的线粒体部分，减少 >50% 溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以 3,000×g 离心 15 min。——这是说明书提供的纯度差速离心参数，实际选择取决于下游应用：① 蛋白 WB 用 12,000×g（得率高）；② 呼吸链活性 / 膜电位检测用 3,000×g（更纯，减少其他细胞器污染）。
抑制剂的添加方式？
使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂 A 和试剂 C 中；仅将抑制剂添加到用于实验的试剂量中，而不是添加到储备溶液中。建议使用 ES-8135（蛋白酶抑制剂混合物）或 ES-8137（蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物）。试剂 B 因即时使用且体积少，无需添加。
组织流程的关键？
硬组织（心脏）流程独特步骤：① 配洗涤缓冲液：试剂 C 与纯水 1:1 混合（如需 1 mL 洗涤缓冲液取 0.5 mL 试剂 C + 0.5 mL 纯水）；② 胰蛋白酶预处理（仅硬组织）：含 0.3 mg/mL 胰蛋白酶 PBS 切块 → 冰浴 3 min → 4℃ 700×g 离心 1 min；③ 加 800 µL 含 4 mg/mL BSA 的 PBS + Polytron/Dounce 均质破坏组织关联；④ 4℃ 1,000×g 离心 3 min，弃上清；⑤ 加 800 µL 试剂 A（加适量 BSA 粉末至终浓度 4 mg/mL），按细胞流程后续步骤。
完整提取流程（动物细胞）？
① 收集 2×10⁷ 细胞，850×g 离心 2 min；② 加 800 µL 试剂 A（含抑制剂），中速涡旋 5 s，冰上孵育 2 min（说明书警告：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性）；③ 加 10 µL 试剂 B，最大速度涡旋 5 s；④ 冰上孵育 5 min（每分钟最大速度涡旋数秒）；⑤ 加 800 µL 试剂 C，倒置数次混合（不要涡旋）；⑥ 4℃ 700×g 离心 10 min（除去未破碎细胞与细胞核）；⑦ 上清转新管，4℃ 12,000×g 离心 15 min —— 更纯度选择：3,000×g 15 min 可减少 >50% 溶酶体和过氧化物酶体污染；⑧ 上清=胞质部分，沉淀=线粒体；⑨ 加 500 µL 试剂 C 重悬后 12,000×g 离心 5 min 洗涤；⑩ 沉淀=纯化线粒体。
起始量？
① 动物细胞：2×10⁷ 个细胞（约 850×g 2 min 离心收集）；② 动物组织：50–200 mg（PBS 中切碎，匀浆机破碎）。如组织较硬如心脏组织，可在含有 0.3 mg/mL 胰蛋白酶的 PBS 溶液中切成小块，冰上孵化 3 min 后 4℃ 700×g 离心 1 min 收集；再加 800 µL 含 4 mg/mL BSA 的 PBS 溶液 + Polytron 或 Dounce 均质器研磨。
本试剂盒的核心特点？
线粒体是细胞代谢的核心。本试剂盒采用成熟的去污剂裂解法，可在不使用超速离心的情况下，从培养细胞或硬/软组织中快速富集线粒体。双方案支持：兼容 Dounce 匀浆法（试剂 C 稀释液）和试剂裂解法。高完整性：维持线粒体外膜完整，适用于下游呼吸链活性、膜电位（JC-1）及蛋白分析。纯度优化：提供差速离心参数，可根据需求降低溶酶体和过氧化物酶体污染。
