EK-1305 FastPure 脂肪组织/细胞RNA提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从动物脂肪组织和细胞总RNA，最多可用于50μg RNA的提取。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

RNAEx ZOL可短期（3-6个月）室温（15℃-25℃）或长期4℃储存，低温有助于延长其效期；其他试剂室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

 无RNase酶的1.5ml离心管

 无RNase酶的吸头

 干净的手套

 低温高速离心机

 物理研磨设备

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

1. Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

2. RNase-Free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。

3. RNA在RNAEx ZOL中时不会被RNase降解(室温短时间2-4h，-80℃长期约3-6个月保存)。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的无酶离心管或玻璃器皿。

操作步骤：

1. 请根据样品种类进行以下步骤（1a为脂肪细胞，1b为脂肪组织）

1a. 收集脂肪细胞：悬浮细胞可直接300×g离心5min并仔细吸除上清留沉淀待使用；单层贴壁细胞可通过直接裂解法（吸尽培养基留下贴壁细胞，进行步骤2裂解）或胰酶处理法（吸尽培养基留下贴壁细胞，用PBS清洗细胞，吸除PBS后使用含0.10%-0.25%胰酶使细胞脱落，加入含有血清的培养基使胰酶失活后转入1.5ml无酶离心管中300×g离心5min，吸除上清留沉淀待使用）

注意：收集细胞数量不要超过1×10⁷，收集细胞时一定要将细胞培养基去除干净，否则会导致步骤2时细胞裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，导致RNA的产量降低。

1b. 脂肪组织匀浆裂解处理：将100mg-150mg脂肪组织转移入1.5ml无酶离心管中并加入1mll RNAEx ZOL，使用研磨杵或电动研磨机将动物组织彻底研磨匀浆。直接进行步骤3.

匀浆时间根据样本裂解难易程度决定，亦可匀浆后静置3-5min延长裂解时间（期间颠倒吹匀2-3次）。RNAEx ZOL有较多有机试剂具一定毒性，匀浆时注意不要溅到皮肤或眼睛等部位，建议使用防护镜操作。

2. 样品裂解：对于1a中使用直接裂解法的细胞应在培养皿或培养瓶中直接加入1 ml RNAEx ZOL破碎细胞，涡旋或吹匀混合。将裂解液移入无酶1.5ml离心管中。涡旋或移液器混合并确保没有细胞团块可见。

细胞沉淀不完全松动吹匀可能会导致裂解效率低下和RNA产量降低。一般≤3×10⁶个细胞若细胞量较大，可涡旋后静置3-5min延长裂解时间（期间颠倒吹匀2-3次）。若不能及时提取，裂解后溶液可至于-80℃储存3-6个月。

3. 将含裂解物离心管置于室温静置2-5min.

该步骤促进核蛋白复合物的解离。若细胞量较少，可不需静置；若细胞量较大，可适当延长静置裂解时间。

4. 向含裂解物离心管中加入200μl Buffer CH, 用力摇动或涡旋15s。

彻底混合对于随后的相分离很重要。

5. 将离心管置于室温静置2-3min.

6. 在4°C下以12,000×g离心15min。

离心后，样品分为3相：上层含有RNA的无色水相；白色的中相间和下层红色有机相。对于脂肪含量特别⾼的组织，红⾊有机相下⽅可能还可⻅⼀层额外的透明相为脂质。⽔相体积约为600 µl。

7. 将上层水相转移到新的无酶1.5ml离心管中，加入约1倍体积无水乙醇，移液器吹打彻底混匀。不要离心，立即进行下一步骤。

加入乙醇后可能会形成沉淀，为正常现象，不会影响提取过程和结果。

8. 将上一步骤混匀后的溶液约700µl转移入RNA吸附柱中并套上2ml收集管，≥8000×g(≥10,000 rpm)室温下离心30s，弃废液。

吸附柱最大上柱量为700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2ml收集管中。

9. 向吸附柱中加入500μl Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE是否按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，弃废液。

10. 重复步骤9一次。

11. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3min干燥柱膜。

12. 将吸附柱套入新的无酶1.5ml离心管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。

若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。

13. 向吸附柱膜正中央加入50-100μl RNase-Free Water，盖上盖子室温静置3-5 min。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到RNA溶液。

RNA洗脱体积不应少于30μl，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。