EK-1306 FastPure植物样品RNA小量提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从植物中提取总RNA，不含酚氯仿等有毒试剂。其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、引物延伸分析、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

RNase-free DNase I和Buffer RDD置于2-8℃保存；Buffer RLT可室温（15℃-25℃）干燥放置至少一年，加入β-巯基乙醇的Buffer RLT可室温放置一个月；其他试剂室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

 14.3 M β-巯基乙醇(β-ME) (常规购买商业化商品即为14.3 M)

 70%乙醇：RNase-free水配制

 无水乙醇（96%-100%）

 无RNase酶的1.5ml离心管

 无RNase酶的吸头

 干净的手套

 高速离心机

 物理研磨设备

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

1. 操作前在Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（β-ME）至终浓度为1%（建议现配现用），如1 ml Buffer RLT中加入10 μl β-巯基乙醇。配好的Buffer RLT可在4℃维持稳定一个月。

2. Buffer RLT在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请37℃加热溶解后室温使用。

3. Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。

4. 如果执行可选的柱上DNA酶消化步骤，请制备DNase I储备液：将DNase I干粉（1500 U）溶解在550μl RNase-free ddH₂O中，轻柔混匀（禁止涡旋），分装后-20℃贮存（可保存9个月）。

5. RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。

6. RNA在Buffer RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的离心管或玻璃器皿。

7. RNA提取操作及离心过程常温进行即可。

操作步骤：

1. 根据情况使用进行以下步骤研磨最多100 mg的植物材料

1a. 立即将组织置于液氮中用研钵和研杵彻底研磨。将组织粉末倒入用液氮提前冷却的无酶2 ml离心管中。让液氮蒸发，但不要使组织解冻。立即继续执行步骤2。

1b. 组织匀浆处理：根据相应研磨设备步骤进行，研磨完成后立即执行步骤2。

2. 加入450 µl Buffer RLT（使用前请检查Buffer RLT是否加入β-巯基乙醇或DTT）最多100 mg组织粉末中，大力充分涡旋。

3. 将离心管放入高速离心机中以最大转速(~13,400×g)离心3分钟。

4. 收集上清并加入新的无酶1.5ml离心管中，同时加入0.5倍体积的无水乙醇混匀。不要离心，混匀后再执行步骤5。

加入乙醇后可能会形成沉淀为正常现象，这不会影响后续的操作步骤。如裂解液吸出400μl则加入200μl无水乙醇混匀。

5. 将步骤4混匀后的溶液转移入RNase-free吸附柱中并套上2ml收集管，≥8000x g（≥10,000rpm）离心1min，弃废液，直至将溶液全部转移完成吸附。

吸附柱最大上柱量为700μl，若溶液过多可分多次上柱。后续操作若无特殊说明吸附柱均置于2ml收集管中。

6. （可选步骤） 向吸附柱中央加入80μl DNase Ⅰ工作液，室温（15℃-25℃）静置15min。配制DNase Ⅰ工作液：取10μl DNase Ⅰ储备液入新的RNase-free 离心管中，并加入70μl Buffer RDD，轻柔混匀。

注意：DNase Ⅰ 对物理变性特别敏感，所以混匀时请上下倒置轻柔混匀，切勿涡旋。请确认DNase Ⅰ 工作液加入到正中央的柱膜上，否则DNase消化效果会不理想。

7. 向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

8. 将吸附柱重收套回收集管中，向吸附柱中加入500μl Buffer RPE（使用前请确认Buffer RPE按要求加入4倍体积无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心30s，弃废液。

9. 重复步骤8一次。

10. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 以最大转速(~13,400×g)离心3分钟干燥柱子。

11. 将吸附柱套入新的无酶1.5ml 离心管管中，并置于无酶环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。

若吸附柱中残留乙醇将会对纯化后的RNA的下游实验造成影响。

12. 向吸附柱膜正中央加入50-100μl RNase-free Water，盖上盖子室温静置2-3 min。后置于离心机中最大转速(~13,400×g)离心3min得到RNA溶液。

RNA洗脱体积不应少于30μl，否则影响洗脱效率。洗脱后的RNA溶液应立即进行下游实验或置于-80℃储存。

常见问题：

1. 柱子堵塞

 样品用量太多:减少样品用量，参照说明书中提供用量建议。

 样品消化不充分:用液氮或研磨仪充分研磨，延长研磨时间。

2. RNA产量低

 试剂准备有误：Buffer RPE没有加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

 洗脱不充分：洗脱液需加到膜中央，增加洗脱体积或次数。

3. RNA降解严重

样品保存有误：非新鲜现取样品应尽量保存RNA Holder等保存液中。

 提取过程耗材及环境污染：提取中使用的吸头、离心管等需经无酶处理，环境应尽量选择无酶环境或洁净环境以减少RNase的影响。