产品描述
产品介绍
本试剂盒可以快速地从土壤中提取总RNA，其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、引物延伸分析、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
室温干燥保存可至少稳定12个月。
需要额外准备的材料
1. 苯酚:氯仿:异戊醇溶液 (25:24:1, v/v, pH6.5-8.0)
2. 无水乙醇（96%-100%）
3. 无RNase酶的1.5ml/15ml离心管
4. 无RNase酶的吸头
5. 干净的手套
6. 高速离心机
7. 物理研磨设备
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
Buffer IRS在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请60℃加热溶解后室温使用。
土壤总RNA提取中的离心过程常温进行即可。
操作步骤：
1. 在15ml无酶离心管中最多添加2g土壤。
2. 分别添加2.5ml PowerBead溶液，0.25ml Buffer RS1溶液和0.8ml IRS溶液。
3. 加入3.5ml苯酚/氯仿/异戊醇溶液（pH 6.5-8.0）（自备）。
4. 将无酶离心管最大速度涡旋15min，直至两相层消失。
5. 停止涡旋后以2500×g室温离心10min。
6. 将上层水相（避免形成中间相和下层苯酚层）转移到无酶15ml离心管中，丢弃苯酚/氯仿/异戊醇等其它层液体。
注意：在有机质含量高的土壤中，两相层将很厚且牢固，取样时需特别注意。
7. 向水相中加入1.5ml Buffer SR3，并涡旋混合。在2–8°C下孵育10min，然后在室温下以2500×g离心10min。
8. 将上清液转移到新的15ml无酶离心管中，注意不要吸到沉淀物（如果有的话）。
9. 在离心管的上清液中加入5ml Buffer SR4，倒置或涡旋混合，在室温下孵育30min。
10. 以2500×g离心30min。
11. 倒弃上清液，将15ml的离心管在纸巾上倒置5min滤干残留液。
12. 摇匀Buffer SR5以混匀并向15ml离心管中添加1ml。通过反复吹打或涡旋将沉淀完全重悬。
注意：如果沉淀难以重悬，请将试管置于45°C的加热块或水浴中10min，然后涡旋。重复直到沉淀重悬。
13. 为每个RNA分离样品准备一个核酸吸附柱（按以下方法预先处理吸附柱）：
13a. 取下15ml收集管（已提供）的盖子，并将核酸吸附柱柱放入其中。
13b. 将2ml Buffer SR5添加到吸附柱中。让其完全重力流过，并收集在15ml的收集管中。
在上样RNA分离样品之前，请勿让色谱柱变干。
14. 将步骤12中的RNA分离样品添加到吸附柱上，使其重力流过进入15 ml收集管。
15. 将1 ml Buffer SR5添加到吸附柱中，并使其完全重力流入15ml收集管中。
16. 将核酸吸附柱转移到新的15ml收集管中。 摇匀Buffer SR6溶液以混合，然后向吸附柱中加入1ml以洗脱结合的RNA。 使Buffer SR6重力流入15ml的收集管中。
17. 将洗脱的RNA转移到无酶2ml离心管中。加入1ml Buffer SR4。至少颠倒一次以混匀，在–20°C的温度下孵育至少10min。
18. 将无酶2ml离心管以13,000×g离心15min以沉淀RNA。
19. 倒出上清液，然后将2ml离心管倒入纸巾中10min以风干沉淀。
20. 将RNA沉淀重悬于100µl SR7溶液中。
常见问题：
1. 可处理的土壤量
本试剂盒处理最多2g的大多数土壤类型。对于有机物含量高的土壤，1g土壤通常可提供足够量的 RNA，同时降低纯化过程中DNA残留的可能性。对于沉积物样品，可以使用更多的土壤，最多可使用多达5g的沉淀物。您可以在步骤9中增加Solution SR4的体积，使其与裂解液的体积相等。
2. 处理不同类型的土壤
RNA 的产量和纯度取决于处理的土壤类型。一些土壤和沉积物可能含有过多的盐分，在步骤10之后，这可以通过一个大的白色或黄色盐粒来观察。这种类型的沉淀可能会导致核酸产量降低。如果您有富含盐分的土壤或沉积物，为了克服加入Solution SR4后颗粒中盐分的沉淀，将样品在室温下孵育30分钟，而不是-20°C。按照协议其余部分的指示进行。
产品规格
- 规格
- 50T、100T
- 货期
- 1-2天
存储条件
室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 RNA 应如何保存？
最终 RNA 沉淀重悬于 100 µL Buffer SR7 中。短期 -20℃（1 周内）；长期 -80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份）。土壤 RNA 因可能含微量腐殖酸残留，长期保存稳定性略差，建议 -80℃ 母液 + -20℃ 工作液双层保存模式。
可以用于哪些下游应用？
其提取的总 RNA 纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于 RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA 差异显示、引物延伸分析、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。扩展：环境 metatranscriptomics、qRT-PCR（特定功能基因如固氮 nifH、降解 catA）、rRNA 高通量测序（活体微生物群落）。24.9 Q：苯酚/氯仿步骤的安全注意？ 要求自备苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1, pH 6.5–8.0）。安全要点：① 必须在通风柜内操作；② 戴防护手套与护目镜；③ 苯酚溅到皮肤立即用聚乙二醇 PEG-400 或大量水冲洗；④ 苯酚需用合适的中性 pH 缓冲液饱和，pH <6.5 会使 RNA 进入有机相，pH >8.0 会使 DNA 进入水相；⑤ 废液按危险化学废液处理。
腐殖酸残留导致下游 PCR 抑制怎么办？
解决策略：① Buffer IRS 是抑制剂去除的关键步骤，必须严格按规范用量加入；② 上 PCR 前模板 10–100 倍稀释以稀释抑制剂；③ 选择对腐殖酸耐受的聚合酶（KAPA HiFi、Phusion）；④ qPCR 前通过模板稀释曲线判断是否抑制；⑤ 必要时上 EK-1103 二次纯化。注意：A260/A230 偏低（<1.5）在土壤 RNA 中常见，但不直接代表抑制水平，建议 PCR 测试为准。
典型得率？
得率取决于土壤类型：① 农田土 1–10 µg；② 森林土 5–20 µg；③ 沙漠土 / 贫瘠土 0.1–2 µg；④ 泥炭土 2–10 µg；⑤ 沉积物（最大 5 g 起始量）：5–30 µg。说明书原文：RNA 的产量和纯度取决于处理的土壤类型。
富盐分土壤如何特殊处理？
一些土壤和沉积物可能含有过多的盐分，在 Buffer SR4 沉淀步骤之后，这可以通过一个大的白色或黄色盐粒来观察。这种类型的沉淀可能会导致核酸产量降低。如果您有富含盐分的土壤或沉积物，为了克服加入 Buffer SR4 后颗粒中盐分的沉淀，将样品在室温下孵育 30 分钟，而不是 -20℃。按照协议其余部分的指示进行。
操作流程关键步骤？
① 15 mL 无酶离心管加 ≤2 g 土壤 + PowerBead/RS1/IRS + 3.5 mL 苯酚/氯仿/异戊醇；② 最大速度涡旋 15 min 直至两相层消失；③ 2500×g 室温离心 10 min → 取上层水相；④ 加 1.5 mL Buffer RS3 涡旋，2–8℃ 孵育 10 min → 室温 2500×g 离心 10 min 取上清；⑤ 加 5 mL Buffer RS4 倒置混合，室温孵育 30 min → 2500×g 离心 30 min；⑥ 沉淀重悬于 1 mL Buffer RS5（重悬难时 45℃ 加热块/水浴 10 min 后涡旋，重复直到沉淀重悬）；⑦ Buffer RS5 预处理柱后上样，使用重力流过（非离心）；⑧ 用 Buffer SR6 洗脱，再加 Buffer SR4 异丙醇沉淀，最终用 100 µL Buffer SR7 重悬。
起始量与典型流程？
规范起始量 ≤2 g 土壤。本试剂盒处理最多 2 g 的大多数土壤类型。对于有机物含量高的土壤，1 g 土壤通常可提供足够量的 RNA，同时降低纯化过程中 DNA 残留的可能性。对于沉积物样品，可以使用更多的土壤，最多可使用多达 5 g 的沉淀物。主要试剂用量（每样品）：2.5 mL PowerBead Solution + 0.25 mL Buffer RS1 + 0.8 mL Buffer IRS + 3.5 mL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1, pH 6.5–8.0，需自备）。
本试剂盒针对土壤样品的核心设计是什么？
土壤 RNA 提取面临两大独特挑战：① 腐殖酸/富里酸与 RNA 共结合并强烈抑制下游酶反应；② 土壤微生物 mRNA 半衰期短。本试剂盒采用「PowerBead Solution 物理破壁 + Buffer RS1 化学裂解 + Buffer IRS 抑制剂去除 + 苯酚/氯仿/异戊醇相分离 」组合工艺，能在保留微生物多样性的同时去除 PCR 抑制剂。
