EK-1313 FastPure土壤样品RNA小量提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒可以快速地从土壤中提取总RNA，其提取的总RNA纯度高，无蛋白质及其它杂质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、mRNA差异显示、引物延伸分析、芯片分析、 Northern Blot、Dot Blot、Slot Blot、Poly A 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。

存储条件

室温干燥保存可至少稳定12个月。

需要额外准备的材料

 苯酚:氯仿:异戊醇溶液 (25:24:1, v/v, pH6.5-8.0)

 无水乙醇（96%-100%）

 无RNase酶的1.5ml/15ml离心管

 无RNase酶的吸头

 干净的手套

 高速离心机

 物理研磨设备

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

  Buffer IRS在储存时可能会形成沉淀， 如果有沉淀出现，请60℃加热溶解后室温使用。

  土壤总RNA提取中的离心过程常温进行即可。

操作步骤：

1. 在15ml无酶离心管中最多添加2g土壤。

2. 分别添加2.5ml PowerBead溶液，0.25ml Buffer RS1溶液和0.8ml IRS溶液。

3. 加入3.5ml苯酚/氯仿/异戊醇溶液（pH 6.5-8.0）（自备）。

4. 将无酶离心管最大速度涡旋15min，直至两相层消失。

5. 停止涡旋后以2500×g室温离心10min。

6. 将上层水相（避免形成中间相和下层苯酚层）转移到无酶15ml离心管中，丢弃苯酚/氯仿/异戊醇等其它层液体。

注意：在有机质含量高的土壤中，两相层将很厚且牢固，取样时需特别注意。

7. 向水相中加入1.5ml Buffer SR3，并涡旋混合。在2–8°C下孵育10min，然后在室温下以2500×g离心10min。

8. 将上清液转移到新的15ml无酶离心管中，注意不要吸到沉淀物（如果有的话）。

9. 在离心管的上清液中加入5ml Buffer SR4，倒置或涡旋混合，在室温下孵育30min。

10. 以2500×g离心30min。

11. 倒弃上清液，将15ml的离心管在纸巾上倒置5min滤干残留液。

12. 摇匀Buffer SR5以混匀并向15ml离心管中添加1ml。通过反复吹打或涡旋将沉淀完全重悬。

注意：如果沉淀难以重悬，请将试管置于45°C的加热块或水浴中10min，然后涡旋。重复直到沉淀重悬。

13. 为每个RNA分离样品准备一个核酸吸附柱（按以下方法预先处理吸附柱）：

13a. 取下15ml收集管（已提供）的盖子，并将核酸吸附柱柱放入其中。

13b. 将2ml Buffer SR5添加到吸附柱中。让其完全重力流过，并收集在15ml的收集管中。

在上样RNA分离样品之前，请勿让色谱柱变干。

14. 将步骤12中的RNA分离样品添加到吸附柱上，使其重力流过进入15 ml收集管。

15. 将1 ml Buffer SR5添加到吸附柱中，并使其完全重力流入15ml收集管中。

16. 将核酸吸附柱转移到新的15ml收集管中。 摇匀Buffer SR6溶液以混合，然后向吸附柱中加入1ml以洗脱结合的RNA。 使Buffer SR6重力流入15ml的收集管中。

17. 将洗脱的RNA转移到无酶2ml离心管中。加入1ml Buffer SR4。至少颠倒一次以混匀，在–20°C的温度下孵育至少10min。

18. 将无酶2ml离心管以13,000×g离心15min以沉淀RNA。

19. 倒出上清液，然后将2ml离心管倒入纸巾中10min以风干沉淀。

20. 将RNA沉淀重悬于100µl SR7溶液中。

常见问题：

1. 可处理的土壤量

本试剂盒处理最多2g的大多数土壤类型。对于有机物含量高的土壤，1g土壤通常可提供足够量的 RNA，同时降低纯化过程中DNA残留的可能性。对于沉积物样品，可以使用更多的土壤，最多可使用多达5g的沉淀物。您可以在步骤9中增加Solution SR4的体积，使其与裂解液的体积相等。

2. 处理不同类型的土壤

RNA 的产量和纯度取决于处理的土壤类型。一些土壤和沉积物可能含有过多的盐分，在步骤10之后，这可以通过一个大的白色或黄色盐粒来观察。这种类型的沉淀可能会导致核酸产量降低。如果您有富含盐分的土壤或沉积物，为了克服加入Solution SR4后颗粒中盐分的沉淀，将样品在室温下孵育30分钟，而不是-20°C。按照协议其余部分的指示进行。