产品描述
产品介绍
本试剂盒是最新一代的无毒无酚提取RNA的方法，可以快速地从血浆及血清中提取包括miRNA在内的无细胞总RNA。本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品级化妆品等用途。
存储条件
试剂室温干燥保存可至少稳定12个月
需要额外准备的材料
1. 100%异丙醇
2. 无水乙醇
3. 80%乙醇（RNase-free水配制）
4. 无RNase酶的1.5ml/2ml离心管
5. 无RNase酶的吸头
6. 干净的手套
7. 高速离心机
开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1. Buffer ML2和Buffer RWT作为浓缩液提供可能会形成沉淀，如果有沉淀出现请37-56℃加热溶解后室温使用。
2. Buffer RWT作为浓缩液提供，在第一次使用前加入2倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
3. Buffer RPE作为浓缩液提供，在第一次使用前加入4倍体积的乙醇（96-100％）以获得工作溶液。
4. RNase-free水中不含任何抑菌因子，室温放置或操作时可能会引入细菌或真菌污染，使用时尽量注意，推荐开瓶后分装保存以减少污染风险保证实验稳定性。
5. 若要处理冷冻血清/血浆样品，请在37°C 的水浴中孵育，直到样品完全解冻并溶解。尽量避免长时间孵育，否则可能会损害RNA的完整性。
操作步骤：
1. 准备血清或血浆或解冻冷冻样品。
注意：样本最优是新鲜获取，或者-80℃储存；长时间样本即使-80℃储存亦有降解的风险与可能。不应使用含有肝素抗凝剂的样本，可能会影响下游RT-PCR反应结果。
2. 将200μl血清或血浆转移到1.5/2ml无酶离心管中。
注意：若需要提取更多体积的样本，后续试剂按比例增加。建议使用1.5ml尖底离心管更有利于沉淀聚集。
3. 加入100μl Buffer ML2，关闭管盖并涡旋>5秒。在室温下孵育3-5分钟。
注意：可以通过涡旋振荡并在室温下孵育3分钟来促进样品裂解，若无条件静置亦可。
4. 加入30μl Buffer RP1，关闭管盖并通过涡旋剧烈混合>20秒。在室温下孵育3分钟。
注意：彻底混合对于后续的相分离很重要。Buffer RP1加入后产生沉淀为正常现象。
5. 在室温下以12000×g离心3分钟。
注意：上清液应为透明无色。
6. 取上清液（约280μl）转移到新的离心管中。
注意：注意勿吸取到沉淀，沉淀为蛋白质复合物。
7. 加入1倍体积异丙醇，涡旋10-20秒充分混匀。
注意：加入1倍体积异丙醇更有助于micoRNA提取，如280μl上清则加入280μl异丙醇。
8. 将全部样品转移到RNA吸附柱中。盖上盖子，以≥8000×g离心15-30秒。丢弃滤液。
9. 将700μl Buffer RWT（使用前请确认Buffer RWT是否按要求加入2倍体积无水乙醇）加入到RNA吸附柱中。盖上盖子，以≥8000×g离心15-30秒。丢弃滤液。
10. 将500μl Buffer RPE （使用前请确认Buffer RPE是否按要求加入4倍体积无水乙醇）加入到RNA吸附柱中。盖上盖子，以≥8000×g离心15-30秒。丢弃流出物。
11. 向RNA吸附柱中加入500μl 80%乙醇。盖上盖子，以≥8000×g离心2分钟。丢弃滤液。
注意：RNA吸附柱内柱取出倒滤液时注意不要接触滤液，防止乙醇残留影响后续结果。
12. 将RNA吸附柱内柱放回收集管中。打开离心柱的盖子，最大转速≥12000×g离心3-5分钟以干燥柱膜。丢弃滤液和收集管。
注意：最大转速应不低于12,000×g
13. 将RNA吸附柱内柱转入新的无酶1.5ml离心管中，并置于无酶的环境中开盖静置5-10min至乙醇晾干。
注意：干燥离心柱膜很重要，因为残留的乙醇可能会干扰下游反应
14. 向吸附柱膜正中央加入20-30μl RNase-free Water，盖上盖子并静置1-2分钟。后置于离心机中 ≥12,000×g(≥13,000 rpm) 离心3min得到RNA溶液。
注意：如果需要更高的RNA浓度，可适当减少RNase-free water洗脱，但离心下来的体积可能会降低导致总产量降低，因为离心柱膜不能充分水合。洗脱液洗脱后的RNA溶液应置于-80℃储存。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
存储条件
室温干燥保存
常见问题 (FAQ)
提取的 RNA 应如何保存？
短期：-80℃（不推荐 -20℃，浓度太低易丢失）。长期：-80℃ 分装储存（每管单次用量 + 备份），避免反复冻融（每次冻融损失 5–15%）。临床样品建议双管 -80℃ 双备份。
cf-RNA 极低浓度如何提高检出率？
策略：① 加大起始体积至 1–2 mL（多管并行后合并洗脱液）；② 减小洗脱体积：如果需要更高的 RNA 浓度，可适当减少 RNase-free water 洗脱，但离心下来的体积可能会降低导致总产量降低，因为离心柱膜不能充分水合——建议 20–30 μL；③ 必要时改用 ddPCR 等超高灵敏度检测。
A260/A280 偏低（<1.7）说明什么？
血清 RNA OD260/OD280 偏低常见。可能原因：① 血清蛋白（白蛋白、IgG）残留；② 异丙醇或 胍盐 残留；③ 浓度过低（<5 ng/μL，NanoDrop 测量误差大）。改进：① 严格做 80% 乙醇漂洗（说明书规范）；② 改用 Qubit 测量；③ 必要时上 EK-1103 二次纯化。
可以用于哪些下游应用？
液体活检应用：① cf-mRNA qRT-PCR（特定基因表达，如肿瘤标志物 mRNA）；② cf-RNA-seq（全转录组测序，需富集或去除 rRNA / 球蛋白 RNA）；③ miRNA panel 分析（本试剂盒同时保留 miRNA）；④ lncRNA panel 分析（如 PCA3、HOTAIR 等癌症 lncRNA）；⑤ circRNA 检测（环状 RNA 在循环中相对富集）；⑥ 病毒 RNA 检测（HCV、HIV、SARS-CoV-2 等）。
80% 乙醇额外漂洗的作用？
在 Buffer RPE 漂洗后再加 500 μL 80% 乙醇漂洗一次。RNA 吸附柱内柱取出倒滤液时注意不要接触滤液，防止乙醇残留影响后续结果。这一额外 80% 乙醇漂洗对去除残留盐（异丙醇、胍盐）十分关键，是本试剂盒区别于普通 RNA 柱法的设计。
血清 vs. 血浆样品采集要点？
血浆推荐：EDTA 或柠檬酸钠抗凝管，禁用肝素（不应使用含有肝素抗凝剂的样本，可能会影响下游 RT-PCR 反应结果）；采血后 30 分钟内 1,500–2,000×g 10 min 离心，再 12,000×g 10 min 去除残余血小板；上清分装 -80℃。冷冻样品：在 37℃ 的水浴中孵育，直到样品完全解冻并溶解。尽量避免长时间孵育，否则可能会损害 RNA 的完整性。严格避免溶血（414 nm A < 0.2）。
操作流程关键参数？
① 200 μL 血清/血浆 + 100 μL Buffer ML2 涡旋 >5 s，室温孵育 3–5 min；② 加 30 μL Buffer RP1，关闭管盖剧烈涡旋 >20 s，室温孵育 3 min（说明书提示：Buffer RP1 加入后产生沉淀为正常现象）；③ 室温 12,000×g 离心 3 min——上清液应为透明无色；④ 取上清（约 280 μL）转移到新管（勿吸取沉淀，沉淀为蛋白质复合物）；⑤ 加 1 倍体积异丙醇（如 280 μL 上清加 280 μL 异丙醇），涡旋 10–20 s 充分混匀（加 1 倍体积异丙醇更有助于 microRNA 提取）；⑥ 转入吸附柱后依次用 700 μL Buffer RWT、500 μL Buffer RPE、500 μL 80% 乙醇漂洗。
典型起始量与得率？
说明书规范起始量 200 μL 血清或血浆，可按比例放大（若需要提取更多体积的样本，后续试剂按比例增加。建议使用 1.5 mL 尖底离心管更有利于沉淀聚集）。典型得率：200 μL 血清 50 ng–500 ng cf-RNA；1 mL 血浆 200 ng–2 μg。cf-RNA 极低浓度（<10 ng/μL）建议用 Qubit RNA HS 而非 NanoDrop 测量。
本试剂盒与 EK-1318（miRNA 高阶）的区别？
本试剂盒采用「Buffer ML2 裂解 + Buffer RP1 沉淀 + 异丙醇调节 + 硅胶膜柱纯化（Buffer RWT/RPE/80% 乙醇三步漂洗）」工艺，是最新一代的无毒无酚提取 RNA 的方法，可快速从血浆及血清中提取包括 miRNA 在内的无细胞总 RNA。EK-1318专门针对极低含量 cf-miRNA 优化；本试剂盒针对总 cf-RNA（含 miRNA + cf-mRNA + lncRNA），不含苯酚更安全。如需研究循环 mRNA 或 lncRNA 标志物，选择本试剂盒；专门做 miRNA 研究选 EK-1318。
