EK-6200 哺乳动物组织/细胞总蛋白提取试剂盒

【保存条件】

EK-6200-A于4℃保存，EK-6200-B于-20℃保存，有效期12个月

【概述】

本试剂盒专为从哺乳动物组织和培养细胞中快速提取总蛋白而设计。配套的高效蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物，能够有效防止蛋白的降解及去磷酸化修饰。

作用强劲：裂解效率高，可在短时间内获得高浓度的总蛋白。

应用广泛：提取的蛋白可直接用于Western Blot、SDS-PAGE、ELISA等基础研究。

双重保护：特别添加磷酸酶抑制剂，适用于信号转导及磷酸化蛋白的研究。

【使用建议】

1. 裂解工作液配制（现用现配）：取1 mL 预冷的 Total Protein Extraction Buffer，加入20 μL抑制剂混合物 (50×) 。充分混匀后置于冰上备用。

2. 样品前处理（全程冰上处理）
贴壁细胞：弃去培养基，用PBS洗涤1-2次。按6孔板每孔加入按6孔板每孔加入150–250 μL含抑制剂裂解液（参考下表）。充分吹打混匀，冰上裂解5分钟，期间上下颠倒混匀2-3次。
悬浮细胞：弃去培养基，用PBS洗涤1-2次，离心收集细胞，弃上清。按50-100万细胞/管的量，加入150–250 μL含抑制剂裂解液，充分吹打混匀，冰上裂解5分钟，期间上下颠倒混匀2-3次。
组织样品：称重后将组织剪碎。按 20 mg 组织/ 150 - 250 μL工作液的比例加入含抑制剂裂解液。使用玻璃匀浆器或电动匀浆器直至组织充分裂解。注：若需高浓度蛋白，可适当减少裂解液用量。

3. 后处理与收集

①　离心：将裂解后的样品4℃、10,000-13,000×g条件下离心5-10分钟

②　收集蛋白：取上清。推荐使用BCA法 (EK-5001) 测定蛋白浓度。所得蛋白样品即可进行后续SDS-PAGE、Western Blot等操作。

【附表：不同培养器皿的裂解液参考用量】

为了达到最佳的裂解效果（通常蛋白浓度在2-4 mg/mL），细胞长满（100%汇合度）时建议参考下表进行加液：

【注意事项】

1. 提升产量：为获取更多蛋白，可将裂解后的样品置于冰上延长裂解5-10分钟（期间可每隔2分钟震荡一次）。

2. “胶状物”处理：裂解过程中出现透明粘稠的胶状物属正常现象，该物质为基因组 DNA 与蛋白质形成的复合物。请根据实验目标选择处理方式：常规检测（推荐）： 若检测胞浆蛋白或多数核蛋白（如常见的转录因子 NF-kappaB、p53 等），无需特殊处理。直接于 4°C 高速离心，取上清液即可满足后续实验需求。深层检测（超声处理）：若需检测与基因组DNA结合极其紧密的蛋白（如组蛋白、染色质重塑复合物等），建议在离心前进行冰上超声处理（短脉冲，避免产热）。超声可机械性打碎DNA链，释放结合蛋白，从而提高此类蛋白的提取回收率。

3. 温控要求：为防止蛋白降解，所有操作务必在冰上或4℃进行。

4. 安全防护：含有化学去污剂，请佩戴实验服及一次性手套操作。