EK-5010 "闪测BCA"-即用型蛋白定量试剂盒

【保存条件】

室温避光保存，有效期12个月。即用型BSA标准品①-⑧于-20℃保存。

【概述】

BCA法是实验室最常用的蛋白定量方法之一。其原理是在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂结合形成紫色的络合物，在562 nm处有强吸收峰。

高灵敏度：可检出蛋白质浓度范围为20-2,000μg/mL。

高兼容性：可兼容5%浓度的SDS、Triton X-100、Tween 20/80。

干扰因素：BCA技术对螯合剂（EDTA > 10mM）和还原剂（DTT > 1mM、β-ME > 0.1%）敏感。若还原剂超标，建议改用耐还原剂的EK-5004 Bradford蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）。

【使用方法】

1. 准备BCA工作液 (Working Reagent)

配制：按50:1的比例混合A液与B液（例如：5 mL A液+100 μL B液）。

观察：若A液有结晶析出，请37℃水浴溶解后使用。混匀后的工作液应为苹果绿色，室温24小时内稳定。

2. 蛋白标准曲线的建立 (微孔板法)

分别取即用型BSA标准品①~⑧各20 μL加到96孔板中 ( BSA标准品使用前须充分溶解摇匀)。

3. 蛋白浓度的检测

①　加样：用1×PBS或0.9%生理盐水将样品适当稀释 ( 可以多作几个梯度，如2倍、4倍、8倍稀释)，加20 μL到96孔板的样品孔中；

②　显色：在同一时间点，将全部标准品孔与样品孔的BCA工作液一并配制并同步加入（每孔200 μL），加液顺序应尽量缩短组内耗时（建议使用排枪或多道移液器一次性加样，避免逐孔手动加样导致组内孔间孵育时间产生数分钟级差异）；加毕后立即轻晃混匀。

③　孵育：37℃放置30分钟（标准法）。

注：低浓度蛋白可60℃孵育30min；普通定性可室温孵育0.5-2h。

④　测定：冷却至室温，使用酶标仪测定562 nm（或540-595 nm之间）的吸光度。

4. 数据计算

①　绘制标准曲线：以BSA标准品①~⑧的已知浓度为横坐标（X，单位μg/mL），以对应孔的吸光度OD值为纵坐标（Y），进行线性回归，得到标准曲线公式：Y = kX + b。

②　计算样品浓度：将样品的OD值（多孔检测取平均值）直接代入当次实验建立的标准曲线公式，反算对应的BSA当量浓度（若样品经过稀释，需再乘以稀释倍数）。截距b已包含空白孔（标准品①）的本底吸光度，代入原始OD即可，无需再单独扣减空白值。注：标准曲线须每次实验同步制作，不可套用历史回归公式。

计算示例：

如标准曲线公式：Y = 0.00058X + 0.05（X为蛋白质浓度（以BSA标准品拟合），单位μg/mL；Y为吸光度OD值）

测得样品OD = 0.60，代入公式：

X = (0.60 − 0.05) / 0.00058 ≈ 948 μg/mL

若样品此前经过4倍稀释，则原始样品浓度 = 948×4 ≈ 3792 μg/mL（即约3.79 mg/mL）。

注：样品(稀释后)的OD值应落在标准曲线的线性范围内(即介于①~⑧标准品OD值区间内)，超出该范围的样品需重新调整稀释倍数后复测。

【注意事项】

1. 显色时间控制：BCA反应不是“终点反应”，颜色会随时间加深。
优化：标准品和样品必须同时加液、同时孵育、同时读数，以确保数据的可比性。

2. 耗材选择：请使用底部透明的平底96孔板（如普通细胞培养板）。若背景值异常升高，请检查稀释液本身是否含有强还原剂（如高浓度DTT）。

3. 波长建议：建议使用最优562nm，若无此滤光片，可选择540-595nm范围。

4. 安全防护：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。