EK-6118 动物组织/细胞线粒体DNA提取试剂盒

产品介绍

本试剂盒采用"先分离、后裂解、再纯化"两段式流程：第一阶段通过差速离心从培养细胞或动物组织中快速富集完整线粒体，无需超速离心；第二阶段用蛋白酶K裂解线粒体，经高盐结合缓冲液处理后，利用硅胶膜吸附柱选择性结合mtDNA，漂洗去除蛋白质、盐分等杂质，低盐缓冲液洗脱，获得高纯度、低核基因组污染的线粒体DNA，可直接用于mtDNA拷贝数qPCR、测序建库、酶切及PCR扩增等下游实验。

存储条件

本产品除Proteinase K Solution和RNase A Solution外，可在室温(15~25℃)保存12个月。低温下Buffer ATL可能会有沉淀形成，使用时需55℃水浴让沉淀完全溶解。Proteinase K溶液和RNase A溶液收到后请分装保存于-20℃。Buffer MSB/MPB/MWB保存于4℃。

需要额外准备的材料

□ 无水乙醇（96%-100%）

□ 无菌1.5mL离心管

开始前注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项：

□ 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

□ Proteinase K Solution和RNase A Solution建议分装保存于-20℃，反复冻融会影响其活性。

□ 小型高速离心机（~13000rpm）

□ 水浴锅温度分别设置至55℃。

开始前试剂准备

□ 按瓶子标签所示，加入相应体积的无水乙醇稀释Buffer AW1/AW2，于室温密封保存。

操作步骤：

I. 细胞/组织线粒体提取

A. 培养细胞样品预处理

（1）使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂A和试剂C中；仅将抑制剂添加到当次使用量的试剂中，而不要添加到储备溶液中。

（2）在2.0ml微量离心管中以~850×g离心2分钟，收获2×10^7个细胞的沉淀，小心吸除并丢弃上清液，所得细胞沉淀直接进入"线粒体分离通用流程"第1步。

B. 动物组织样品预处理（50-200mg）

（1）使用前立即添加蛋白酶抑制剂（自备）至试剂A和试剂C中；仅添加到当次使用量中。洗涤缓冲液配制：将试剂C与纯水1:1混合摇匀（如需1ml洗涤缓冲液，取0.5ml试剂C加入0.5ml纯水混匀即可，供通用流程第7步使用）。

（2）取50-200mg组织于PBS中切碎，使用匀浆机破碎组织关联，操作中应尽量减少细胞破裂。硬组织（如心脏）可先在含0.3mg/ml胰蛋白酶的PBS中切成小块，冰上孵育3分钟后，4℃、700×g离心1分钟，弃上清并收集组织颗粒，加入800μL含4mg/ml BSA的PBS，使用Polytron或Dounce匀浆器研磨。

（3）组织匀质物4℃、1000×g离心3分钟，小心吸除并丢弃上清液，所得组织沉淀进入"线粒体分离通用流程"第1步（该步骤中另需补加BSA干粉至终浓度4mg/ml）。

C. 线粒体分离通用流程（细胞、组织沉淀通用）

以下步骤适用于经A或B预处理获得的沉淀，操作完全相同，仅第1步、第7步因样本来源略有差异（见括号内说明）。

1. 加入800μL线粒体分离试剂A（组织样本需另补加适量BSA干粉至终浓度4mg/ml），中速涡旋5秒，将试管置于冰上孵育2分钟。

2. 加入10μL线粒体分离试剂B，最大速度涡旋5秒。

3. 将试管置于冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。

4. 加入800μL线粒体分离试剂C，倒置试管数次混匀（不要涡旋）。

5. 将离心管4℃、700×g离心10分钟。

6. 将上清液转移至新的2.0ml离心管中，4℃、12,000×g离心15分钟。

7. 将上清液（胞质部分）转移至新管中弃去，沉淀即为富集的线粒体。

8. 细胞样本：加入500μL线粒体分离试剂C重悬沉淀；组织样本：加入500μL洗涤缓冲液（配制见预处理B-1）重悬沉淀。随后12,000×g离心5分钟，弃去上清液，所得沉淀即为纯化后的线粒体，用于后续DNA裂解步骤。

注意：孵育时间不要超过2分钟，以避免损害线粒体完整性；如需获得更纯的线粒体组分、减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染，可将第6步离心条件改为3000×g、15分钟；线粒体沉淀应尽快进入下一步裂解，冻融可能损害其完整性。

II. 线粒体DNA提取纯化

1. 向线粒体沉淀中加入200μL线粒体裂解液，充分振荡悬浮沉淀，确保无明显团块。

2. 加入20μL蛋白酶K（20mg/ml），涡旋混匀。

3. （可选）加入4μL RNase A（20mg/ml），涡旋混匀，室温放置2分钟以去除RNA污染。

4. 置于56℃金属浴或水浴中孵育10-30分钟至裂解液变澄清；若样本量较大或裂解不完全，可延长孵育时间至1小时，期间间歇涡旋混匀。

5. 加入200μL结合缓冲液，充分涡旋混匀约15秒。

6. 加入200μL无水乙醇（96%-100%，自备），充分涡旋混匀约15秒；此时溶液中出现少量白色絮状物属正常现象。

7. 将上一步所得混合液（含絮状物）全部转移至套有收集管的DNA纯化吸附柱中，室温12,000×g离心1分钟，弃流出液及收集管，将吸附柱置于新收集管中。

8. 向吸附柱中加入500μL漂洗液1（首次使用前须按标签说明加入指定体积的无水乙醇），室温12,000×g离心1分钟，弃流出液，吸附柱放回收集管。

9. 向吸附柱中加入500μL漂洗液2（首次使用前须按标签说明加入指定体积的无水乙醇），室温≥13,000×g离心3分钟，弃流出液。

10. 将吸附柱开盖，室温放置2-3分钟，或以≥13,000×g空甩离心1分钟，彻底去除膜上残余乙醇。

11. 将吸附柱转移至干净的1.5ml离心管中，于膜中央加入30-100μL洗脱缓冲液，室温静置1-5分钟，12,000×g离心1-2分钟，收集管中的液体即为线粒体DNA。