产品描述
产品介绍
本试剂盒采用彩色溶液配方，提取步骤更清晰可视。同时应用先进的硅胶膜吸附技术，操作简单、快速。菌体经碱裂解法处理后通过离心吸附柱，专一性结合DNA，洗去杂质，高效快速提取多至40μg的质粒DNA。本试剂盒采用独特的缓冲液配方，最大限度去除蛋白杂质及其它有机化合物，每次可处理1-5mL菌液。得到的DNA比传统试剂盒纯度更高，可直接用于酶切、转化、测序及PCR等分子生物学实验。
存储条件
除RNase A Solution外，其余组份在室温（15-25°C）下干燥保存稳定至少12个月。RNase A Solution收到后请冻于-20°C，加至Buffer P1后混合液保存于4°C。
需要额外准备的材料
□ 无水乙醇（96%-100%）
□ 无菌1.5mL/2mL离心管
开始前注意事项
□ Buffer P1为粉红色澄清溶液，Buffer P2为紫红色澄清溶液，Buffer N3为黄色澄清溶液。
□ Buffer P2和Buffer N3如有混浊现象，可在37℃水浴中加热5-10min即可恢复澄清。
□ 处理低拷贝质粒时，按比例扩大Buffer P1、Buffer P2和Buffer N3的用量，可处理5~10mL细菌培养液。
□ 质粒提取所有步骤都在室温（15-25°C）下进行。
□ 试剂颜色不会影响到质粒提取的浓度及纯度，请放心使用。
开始前试剂准备
□ 短暂离心RNase A Solution管，把全部RNase A Solution转移至Buffer P1中，并于2-8℃保存。
□ 按瓶子标签所示，加入4倍体积的无水乙醇稀释Buffer PW（按瓶身指示），于室温密封保存。
DNA浓度及纯度检测：
回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
OD260/OD280比值应为1.7-2.0，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
操作步骤：
1. 将含质粒的菌种接种（1:500-1:1000接种）于含1~5mL LB-抗生素培养液的10-20mL培养管中，37℃摇床培养12~16h。
2. 将菌液加入离心管中，使用常规台式离心机，≥8000×g(≥10,000 rpm) 离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
3. 倒弃培养基，在吸水纸轻轻拍打吸尽残液（或用吸头吸尽）。加入250µL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），高速涡旋（或吸头吹打）重悬细菌至无菌块。
加完Buffer P1后溶液为粉红色，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4. 往离心管中加入250µL Buffer P2，温和颠倒混匀8~10次。
不要涡旋！轻轻颠倒混匀即可，涡旋会引起细菌基因组DNA污染。溶液变得粘稠而透亮表明细菌已充分裂解。如有必要，可室温放置2min，这一步操作时间不要超过5min以免质粒受到破坏。此时溶液应变为紫色。
5. 向离心管中加入350µL Buffer N3，立即温和地上下翻转8~10次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。最大转速(~13,400×g )离心10min。
不要涡旋！加入 Buffer N3 后立即温和翻转，观察到溶液由紫色转变为均匀黄色，并伴随大量白色絮状沉淀，即表示中和完全。
注意：如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6. 将上一步收集的上清液用移液器吸入到吸附柱中，注意尽量不要吸到沉淀。≥8000×g (≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
这一步须室温离心，低温离心会引起SDS析出而无法获得澄清的上清液。吸附柱单次上柱最大容量为700µL，请勿超过吸附柱单次上柱最大容量，可分批多次离心。
7. 向吸附柱中加入500µL漂洗液Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），≥8000×g(≥10,000 rpm)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
8. 重复操作步骤7一次。
9. 倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中, 最大转速 (~13,400×g)离心2min以干燥吸附柱膜，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，
10. 将吸附柱转移至新的无菌1.5 mL离心管中，开盖室温静置5-10 min以彻底去除残留乙醇。后加入30-60µL Buffer EB（或无菌ddH2O）至柱子的膜中央并盖上盖子静置1-2min，最大转速(~13,400×g)离心2min以洗脱DNA至离心管。
柱子最低的洗脱体积为30µL，低于30µL会导致洗脱效率下降。30µL可洗脱60-70%的质粒DNA，50µL可洗脱出80-85%的质粒DNA。若追求最大产量，可重复操作本步骤进行第二次洗脱。Buffer EB在55-60℃预热后加入膜中央洗脱也可提高质粒获得率。
11. 弃去柱子，将质粒DNA溶液于-20℃保存或进行下游实验。
常见问题：
1. 质粒DNA产量低
细胞未充分裂解：细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。
试剂准备有误：Buffer P2若有沉淀析出需使用前加热溶解。Buffer PW需加入乙醇稀释或体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。
质粒拷贝数：载体应拷贝数差异会造成质粒产量明显波动。高产量载体常有2~3倍的产量波动。长片段质粒（>7kb）和表达型载体常为中低拷贝数质粒，每毫升菌液的产量约为0.5~2µg，需加大菌液量提取。
菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好划线活化以稳定产量。
2. 基因组污染
培养时间过长：培养时间应控制到12~16h。
裂解问题：加入Buffer P2后应该轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，加入Buffer P2时算起，总时间不要超过5min。
产品规格
- 货期
- 1-2天
- 规格
- 50T、100T
应用领域
本产品适用于EK-1001、质粒提取、生物科研试剂、ECOTOP SCIENTIFIC等研究领域。ECOTOP SCIENTIFIC（广州亿涛生物科技有限公司）提供高品质生物科研试剂，服务科研院所与生物医药企业。
存储条件
室温（15-25°C）下干燥保存
常见问题 (FAQ)
使用本试剂盒提取的质粒可用于哪些下游应用？
本试剂盒提取的质粒 DNA 适用于常规分子生物学实验，包括限制性内切酶酶切、PCR 扩增、Sanger 测序、连接转化、克隆构建以及非敏感细胞系的常规转染等。对于内毒素敏感的实验（如原代细胞转染、动物体内实验），请改用 EK-1005 去内毒素试剂盒。
提取后的质粒 DNA 应如何储存？
短期使用建议 4℃ 储存（1–2 周内使用完毕）；长期储存建议分装后 -20℃ 冻存，避免反复冻融。RNase A Solution 收到后请 -20℃ 冻存，加入 Buffer P1 后混合液保存于 2–8℃。若用 ddH₂O 洗脱，更应立即分装冻存以避免水解。储存超过 6 个月的质粒，建议重新检测浓度与电泳条带完整性。
提取的质粒 DNA 可以直接用于哺乳动物细胞转染吗？
可以用于普通细胞系（如 HEK293、HeLa）的常规转染，但本试剂盒未单独添加去内毒素步骤，因此对于敏感细胞（原代细胞、巨噬细胞、树突细胞、干细胞）或体内实验，建议改用 EK-1005 彩色去内毒素质粒小量提取试剂盒，其在 PW 漂洗前增加了 Buffer EF 去内毒素步骤。
为什么我的洗脱液里有少量基因组 DNA 残留？
基因组 DNA 污染主要源于裂解步骤涡旋震荡（错误操作）或裂解时间过长。本试剂盒明确要求：加入 Buffer P2 后只能温和颠倒混匀 8–10 次，不要涡旋；从加入 P2 起总操作时间不超过 5 min，超时会导致质粒受损；同时菌液培养时间应控制在 12–16 h，过夜培养超过 16 h 也会增加基因组污染风险。
A260/A280 比值低于 1.7 通常意味着什么？
本试剂盒提取的质粒，OD260/OD280 理想值为 1.7–2.0。比值低于 1.7 通常提示有蛋白质或苯酚残留污染（蛋白在 280 nm 强吸收）。常见原因：裂解不彻底、Buffer N3 未充分混匀、Buffer PW 漂洗不到位（请确认 PW 已加 4 倍体积无水乙醇稀释）。如果使用 ddH₂O 而非 Buffer EB 洗脱，比值也会偏低，但这是 pH 与离子条件影响光吸收的正常现象，不代表纯度差。建议增加一次 PW 漂洗或重新过柱。
彩色裂解液有什么作用？
本试剂盒采用三色可视化指示：Buffer P1 为粉红色（重悬细菌后应为均匀粉红）、Buffer P2 为紫红色（混匀后溶液变紫色，提示已裂解）、Buffer N3 为黄色（中和后溶液由紫色完全转为均匀黄色，并伴大量白色絮状沉淀，表示中和完全）。颜色未变化或不均匀，说明混合不充分，应继续温和颠倒；这种可视化设计能显著降低操作失误率。
提取的质粒 DNA 典型得率是多少？
高拷贝质粒（如 pUC 系列）使用本试剂盒从 1–5 mL 过夜培养物中最高可获得 40 µg 质粒 DNA；长片段（>7 kb）或表达型载体多为中低拷贝质粒，每毫升菌液得率约为 0.5–2 µg，建议加大菌液量或换用大规格试剂盒。30 µL Buffer EB 可洗脱 60–70% DNA，50 µL 可洗脱 80–85%，追求最高产量时可重复洗脱一次。
使用 5 mL 过夜培养物为何质粒得率反而偏低？
本试剂盒单次推荐处理 1–5 mL 菌液（37℃ 摇床 12–16 h，1:500–1:1000 接种）。当菌液 OD600 过高或培养时间 >16 h 时，菌体过多导致 Buffer P1/P2 的标准用量（各 250 µL）不足以充分裂解，反而使硅胶膜柱过载、产生基因组 DNA 污染。建议加 P2 后温和颠倒混匀 8–10 次（不要涡旋），从加 P2 算起总操作时间不超过 5 min；若处理低拷贝质粒，按比例同步扩大 P1/P2/N3 用量再处理 5–10 mL 菌液。
使用本试剂盒时，离心步骤应在什么温度下进行？
所有步骤须在室温（15–25℃）下进行，包括离心。低温离心会引起 SDS（来自 Buffer P2/N3 中和后体系）析出，导致无法获得澄清上清液，反而堵塞硅胶膜柱、降低得率。
在 FastPure 彩色质粒小量提取试剂盒的洗脱步骤中，可以用水代替 Buffer EB 吗？
强烈建议使用试剂盒提供的 Buffer EB 以获得最佳得率与稳定性。可以使用无菌 ddH₂O 进行洗脱，但水的 pH 不稳定可能导致质粒 DNA 在长期储存中发生水解，并使 OD260/OD280 检测值偏低。如果用水洗脱，建议立即分装并 -20℃ 冻存。Buffer EB 在 55–60℃ 预热后加到柱膜中央洗脱，可进一步提升得率。
在FastPure彩色质粒小量提取试剂盒试剂盒中，离心步骤应在什么温度下进行？
当未指定温度时，我们建议在室温下进行离心步骤。
我可以在EK-1001 FastPure彩色质粒小量提取试剂盒 核酸纯化试剂盒的洗脱步骤中使用水代替洗脱缓冲液吗？
我们强烈建议在洗脱步骤中使用提供的洗脱缓冲液以获得最佳结果。您可以使用无核酸酶水；但可能会影响纯化过程中的核酸产量及其储存期间的稳定性。
